双管齐下：多功能材料助力食品中黄曲霉毒素B1的可靠性分析

1.引言

各国对AFB1含量有严格限制，但储存和运输过程中的污染风险仍然存在。为实现对AFB1的敏感监测，研究人员开发了色谱法和免疫分析法等分析方法，但这些方法成本高、操作繁琐。核酸适体作为新一代分子识别元件，在AFB1快速测定中表现出色，特别是基于光学和电化学策略。然而，AFB1本身的荧光特性和食物基质的复杂性会影响检测结果的准确性。为提高精度，可引入比例荧光探针或多模态结果输出方法进行校正。Fe₃O₄纳米颗粒因其类过氧化物酶活性而备受关注，通过与其他材料复合以及表面修饰生物分子，可以进一步增强其性能和催化活性。核酸适体能够可逆地调节纳米酶的催化活性，为开发基于ssDNA调控的新型适体传感器提供了可能，但ssDNA对纳米酶类酶活性的影响机制尚不明确，需要进一步研究。

本研究报道了一种通过氨共沉淀法合成GO-Fe₃O₄配合物，该配合物兼具GO对ssDNA的吸附性和Fe₃O₄的超顺磁性，且ssDNA能增强其过氧化物酶样活性。研究发现，GO-Fe₃O₄与ssDNA主要通过π-π堆积、疏水相互作用、范德华力和氢键结合，ssDNA/GO-Fe₃O₄通过增强对TMB的亲和力来提升催化能力。基于此，构建了比率荧光/比色双模分析平台用于检测AFB1，利用GO-Fe₃O₄的超顺磁性和可修饰酶活性进行双模分析，相互验证结果以提高可靠性。该平台在AMCA标记的适体和红色荧光CuNPs之间获得比例荧光信号，实现内置校正并抵抗环境干扰。这项研究为生物传感器的特性调制提供了新思路，有助于生物传感器的设计和性能提升。

方案1.基于适配体吸附GO-Fe₃O₄的AFB1检测双模生物传感器示意图。

2.结果与讨论

氧化石墨烯-Fe₃O₄对ssDNA的吸附

本研究采用氨共沉淀法合成GO-Fe₃O₄，并通过荧光、琼脂糖凝胶电泳和zeta电位验证了GO-Fe₃O₄对ssDNA的有效吸附和磁分离能力。荧光结果表明，随着GO-Fe₃O₄浓度增加，AMCA标记的适体荧光强度逐渐猝灭。凝胶电泳显示，适体能被GO-Fe₃O₄有效吸附和分离。Zeta电位分析进一步证实了适体在GO上的吸附。分子间力研究表明，静电斥力、π−π堆积效应（尤其是胞苷和鸟苷）、疏水相互作用、氢键和范德华力共同影响GO-Fe₃O₄对ssDNA的吸附，高温可增强疏水相互作用，而95℃高温会破坏部分氢键和π-π堆积，导致DNA脱附。

图1.(A)a.GO-Fe₃O₄对适配体的吸附和磁分离示意图。b.凝胶电泳样品孔图。c.GO-Fe₃O₄适配体吸附和磁分离后的溶液琼脂糖凝胶电泳。(B)适配体、GO-Fe₃O₄和被适配体吸附的GO-Fe₃O₄的ζ电位。

ssDNA增强GO-Fe₃O₄纳米酶活性的机制

本文评估了GO-Fe₃O₄的催化性能，发现其可催化H₂O₂将TMB氧化为oxTMB，且适体吸附能有效增强酶活性。EPR光谱证实GO-Fe₃O₄可催化H₂O₂生成-OH，循环伏安法表明GO-Fe₃O₄能促进电子转移。稳态动力学实验表明，适体吸附增强了GO-Fe₃O₄对TMB的亲和力，降低了对H₂O₂的亲和力。研究还发现，ssDNA的碱基组成、浓度和序列长度会影响GO-Fe₃O₄的催化活性，其中A碱基的ssDNA催化活性最高。实验确定了最佳催化pH为3.5，最佳温度为37℃，且TMB和H₂O₂浓度越高，纳米酶的催化能力越强。

图2.(A)不同反应体系的紫外-可见吸收光谱及相应照片。(B)不同体系的DMPO/•OH加合物的EPR信号。(C)不同反应条件下TA溶液的荧光光谱。(D)循环伏安曲线。在TMB和H₂O₂浓度固定的情况下，分别进行了GO-Fe₃O₄（E和G）稳态动力学分析和GO-Fe₃O₄（I和K）和适配体/GO-Fe₃O₄（J和L）催化活性的双倒数图。

AFB1双模检测

该传感器利用AMCA标记的适体靶向结合AFB1，游离的AMCA-适体附着在GO-Fe₃O₄上，通过磁分离分别在上清液和沉淀物中进行比例荧光和比色分析。比例荧光模式基于AMCA和CuNPs的荧光变化，比色模式基于GO-Fe₃O₄催化底物的颜色变化。实验结果表明，适体能特异性识别AFB1，HP能与适体/AFB1复合物结合。优化培养时间、温度和试剂浓度后，确定GO-Fe₃O₄的最佳反应条件为37℃、15min，AFB1与适体结合的最佳条件为25℃、60min，HP浓度为0.4μM，AA和CuSO₄的最佳反应浓度分别为1mM和0.1mM。

图3.(A)识别AFB1前后适配体的CD谱图。(B)琼脂糖凝胶电泳用于AFB1和HP与适配体的竞争结合。(C)在AFB1存在和不存在的情况下，提出的比例荧光模式的荧光光谱。

分析性能

本文在优化的实验条件下，采用比例荧光和比色两种模式检测AFB1。比例荧光模式下，荧光强度比（F450/F600）与AFB1浓度在0.1~150μg/L范围内呈良好线性关系，LOD为0.0372μg/L。比色模式下，652nm处吸光度值与AFB1浓度在0.1~150μg/L范围内呈线性关系，LOD为0.0492μg/L。

图4.(A)加入不同浓度AFB1后分析平台的比例荧光光谱。(B)AFB1浓度与F450/F600的关系。(C)A0-A与AFB1浓度的关系.

通过ImageJ分析真彩色图像的结果与荧光光谱分析结果基本一致，LOD分别为0.045μg/L和0.087μg/L，验证了该双峰生物传感器对AFB1的敏感分析能力，且优于或可与之前报道的大多数AFB1生物传感器相媲美。靶标选择性研究表明，比例荧光模式下可通过荧光发射峰位置判断AFs种类，比色模式下对AFB1类似物的响应明显低于AFB1，突出了双模分析方法相互验证的优势。

图5.(A)通过ImageJ将上清在比例荧光模式下的紫外真彩色图像拆分为R（红色）、G（绿色）和B（蓝色）通道。(B)比例荧光模式下B/（R×G）值与AFB1浓度的关系。(C)通过ImageJ将可见光下比色模式下溶液的真彩色图像拆分为R、G、B通道。(D)比色模式下B/（R×G）值与AFB1浓度的关系。

3.总结

本研究设计了一种通过氨共沉淀法合成的GO-Fe₃O₄具有过氧化物酶样活性，其催化途径是通过H₂O₂分解生成•OH和电子转移过程实现的。ssDNA通过多种作用力吸附在GO-Fe₃O₄表面，并增强其对TMB底物的亲和力，进而提高其过氧化物酶样活性。基于此及氧化石墨烯的超顺磁性，构建了AFB1的比例荧光/比色双峰检测方法，性能良好。双模生物传感器可相互认证检测结果，提高准确性和置信度。利用ImageJ软件对真彩色图像RGB通道进行可视化定量分析，为生物传感器用于食品安全快速检测提供可能。该传感器具有成本低、灵敏度高、特异性强、操作简单、快速、可靠、可扩展等优点。研究表明，基于DNA/GO-Fe₃O₄相互作用的生物传感器具有广阔的应用前景，结合智能手机的RGB分析软件，可用于AFB1的快速现场检测，且通过改变适体和HP序列，有望检测其他污染物。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116594