RT-RPA与RPA-LFA技术：快速超灵敏检测副溶血性弧菌的新方法

副溶血性弧菌的威胁

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种常见的食源性机会致病菌，主要存在于世界各地的河口和海口区域，尤其在温带和热带地区。食用受污染的生或未煮熟的海产品是其主要传播途径，此外，通过受污染的水或接触感染者伤口也可传播。感染副溶血性弧菌可导致轻度胃肠炎或原发性败血症，严重时可引起伤口感染和继发性败血症。为了有效预防和控制由副溶血性弧菌引起的食物中毒，建立一种快速、灵敏的检测方法至关重要。

传统检测方法的局限性

传统的副溶血性弧菌检测方法主要依赖于富集培养法，但该方法工作量大、检测周期长且灵敏度有限，无法满足快速检测的需求。近年来，基于免疫学和分子生物学的检测方法逐渐兴起，但这些方法需要专业操作人员和设备，实用性受到一定限制。相比之下，重组酶聚合酶扩增（RPA）技术作为一种新兴的恒温核酸扩增技术，具有实验周期短、操作简便、设备要求低等优点，适用于食品安全领域的快速检测。

新方法的研发：RT-RPA与RPA-LFA

南京农业大学食品科学与技术学院的研究团队开发了两种基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术的快速检测方法：实时荧光RPA（RT-RPA）和RPA结合侧流层析（RPA-LFA）方法。这两种方法利用了RPA技术的优势，即实验周期短、操作简单、设备要求低，适用于食品安全领域的快速检测。

研究中，研究人员选择了副溶血性弧菌的两个新特异性靶标基因（VP0488和VPA1585），并基于RPA技术开发了两种快速检测方法。RT-RPA方法通过荧光探针实现实时检测，而RPA-LFA方法则结合侧流层析试纸条实现可视化检测。两种方法均能够在20分钟内完成DNA扩增，并在5分钟内通过LFA条带实现扩增产物的可视化。

新方法的灵敏度与特异性

研究结果表明，RT-RPA和RPA-LFA方法对副溶血性弧菌的检测具有高灵敏度和高特异性。在纯化DNA样本中的检测灵敏度达到10 fg/μL，而在细菌纯培养物中的检测灵敏度达到4.5 CFU/mL。此外，这两种方法对常见食源性致病菌和其他弧菌属细菌均无扩增，显示出良好的特异性。

图1 实时荧光重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）的灵敏度评估结果。A：RT-RPA对DNA模板的灵敏度；B：DNA模板灵敏度的标准曲线；C：RT-RPA对细菌悬液模板的灵敏度；D：细菌悬液模板的标准曲线。

图2 RPA-LFA方法的灵敏度评估结果。A：RPA-LFA方法对DNA模板的灵敏度；B：RPA-LFA方法对细菌悬液模板的灵敏度。

图3 RT-RPA和RPA-LFA的特异性评估。A：RT-RPA对阴性菌株的检测结果；B：RT-RPA对阳性菌株的检测结果；C：RPA-LFA对10种阴性菌株的检测结果。

RT-RPA与RPA-LFA双重检测系统的构建

为了进一步提高检测效率，研究人员还构建了基于两个靶基因的双重RT-RPA和双重RPA-LFA方法。双重检测系统能够同时检测VP0488和VPA1585两个靶基因，进一步提高了检测的准确性和可靠性。

图4 双重RPA-LFA方法的灵敏度评估结果。A：双重RPA-LFA方法对DNA模板的灵敏度；B：双重RPA-LFA方法对细菌悬液模板的灵敏度。

实际样本检测

研究人员将RT-RPA和RPA-LFA方法应用于实际食品样本的检测，结果显示，这两种方法能够准确快速地检测出牡蛎、蛤蜊、鳕鱼和虾等样本中的副溶血性弧菌，回收率在85.11%至118.78%之间，显示出良好的实际应用潜力。

表1 RT-RPA法样品加标回收率测定结果

图5 实际样品中副溶血性弧菌的检测情况

结论与展望

本研究成功开发了两种基于RPA技术的快速检测方法，用于检测副溶血性弧菌。这两种方法不仅具有高灵敏度和高特异性，还能够在短时间内完成检测，适用于现场快速检测和资源有限的环境。未来，研究人员将进一步优化这些方法，提高其检测性能，并探索其在其他食源性病原菌检测中的应用。

RT-RPA和RPA-LFA方法的开发为食品安全监测提供了新的技术手段，有望在食品安全应急响应和公共卫生保障中发挥重要作用。随着技术的不断进步和应用，这些方法将为实现食源性病原菌的早期筛查和精准防控提供更有力的支持。

参考文献：

Hu A, Chen H, Shi C, et al. RT-RPA and RPA-LFA assay for rapid and ultrasensitive detection of Vibrio parahaemolyticus[J]. Food Control, 2024, 166: 110732.