多重基因组编辑消除了乳酸的产生，而不影响哺乳动物细胞的生长速率

瓦博格效应（Warburg effect）描述的是即使在氧气存在下葡萄糖发酵成乳酸，在包括癌细胞在内的增殖哺乳动物细胞中普遍存在，但由于乳酸积累抑制细胞生长和蛋白质生产，对生物制药生产提出了挑战。由于乳酸脱氢酶对细胞生长至关重要，以前的消除细胞中乳酸产生的方法失败了。在这里，作者通过同时敲除乳酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶激酶，大大消除了中国仓鼠卵巢和人类胚胎肾细胞系HEK293中的乳酸产生，从而消除了一个通常抑制丙酮酸转化为乙酰辅酶A的负反馈回路。这些细胞，作者称之为零瓦博格细胞，维持野生型生长速率，同时产生可忽略的乳酸，显示出氧消耗的代偿性增加，几乎完全依赖氧化代谢，并在分批细胞培养中显示出更高的细胞密度。零瓦博格细胞仍然能够生产多种生物治疗蛋白，达到工业相关的滴度，并维持产物的糖基化。消除乳酸生产的能力可能有助于生物治疗生产，并为研究一种常见的代谢现象提供了一个工具。

关键发现：

1、 当零瓦博格细胞重新连接中心代谢但生长正常

图1 零瓦博格克隆体的生长速率、葡萄糖摄取和长期传代

图2 零瓦博格细胞增加了氧化代谢

据推测，瓦伯格效应对细胞增殖是必要的，因为它允许产生生物量前体。虽然最初的测试没有显示一个影响任何生长速度保证克隆，确保随着时间的推移，零瓦伯格表型不会被选择（如果产乳酸行为对生长有益），作者将0-F5克隆和克隆只有1、2或3的pdk淘汰（分别为4-B6、2-G1和C5）长期常规传代。传代87天后，所有非野生型的细胞均保持稳定的瓦伯格阴性状态。因此，瓦伯格效应对于细胞增殖是不可或缺的。这些结果都与葡萄糖衍生的丙酮酸进入线粒体进行完全氧化的数量增加相一致。总的来说，虽然瓦伯格代谢似乎不是必要的，但瓦伯格缺失的细胞表现出代偿性的增加，并依赖于线粒体氧化代谢来产生ATP。

2、  零瓦伯格细胞表现出氧化还原代谢失调

图3 零瓦伯格细胞表现出氧化还原状态和代谢的扰动，尽管这些变化可能取决于克隆体、细胞系和有机体特异性

由于Ldha可以再生成NAD+，作者研究了它的敲除如何影响细胞的氧化还原平衡。在中期指数生长过程中测量的细胞内代谢组学显示，NAD/NADH比值显著下降，这是由于NADH水平的大幅增加，而NAD+水平的增加并没有完全补偿，这与Ldha介导的NADH循环的损失相一致。可能是为了缓解这种下降，0-F5细胞系显示了细胞内甘油-3-磷酸池的显著增加以及NAD+再生酶Gpd1的上调。来自其他克隆（0-B6和0-F4）和CHO-K1衍生的零瓦伯格细胞系的转录组数据也表明NAD/NADH水平失调，所有克隆都显示出利用NAD/NADH和/或代谢前体的几种代谢酶表达水平的改变，以及Sirt1激活的证据。总之，这些发现强烈地表明，可能存在几种细胞状态，允许在哺乳动物细胞中出现零瓦伯格表型。

3、 零瓦伯格的细胞可以产生多种治疗性蛋白，且零瓦伯格态可以引入单克隆抗体生产细胞

图4 零瓦伯格细胞可以作为一个新的宿主细胞系，或者表型可以被引入现有的生产克隆细胞系

为了验证作者敲除Ldha和Pdk基因并没有破坏细胞的蛋白质分泌能力，作者用多种生物治疗药物转染了零瓦伯格克隆，包括Enbrel（依那西普）以及非含fc结构域的药物，包括促红细胞生成素、C1酯酶抑制剂和生长/分化因子。成功地获得了产生每种蛋白质的克隆细胞系，表明该表型在蛋白质生产中具有广泛的适用性。最后，为了验证获得具有意义的产品滴度的克隆能力，作者使用了BESTCell技术。表明零瓦伯格细胞与已建立的CLD协议兼容，并显示出作为宿主细胞系的适用性。

经过初步的鉴定和培养基筛选，作者发现，与不产生零瓦伯格克隆一致，与亲本和模拟品系相比，没有Ldha的单克隆抗体产生细胞表现出更好的生长行为。蛋白质滴度保持在与亲本品系相似的水平。此外，产物的糖基化作用仍保持不变。因此，零瓦伯格表型可以引入现有的生物制药细胞，而不损失蛋白质生产或产品质量。

结论

在这里，作者报道了Warburg效应可以通过去除增殖的哺乳动物细胞系中的Ldh和外周调节因子来消除。工程CHO细胞显著降低了它们的葡萄糖消耗，同时乳酸分泌接近零。令人惊讶的是，细胞保持快速增殖，并且在补料中细胞培养时，表现出一个延长的生长阶段。这可能是由于避免了中等高渗浓度，因为碱的添加不需要中和乳酸。总之，作者发现通过消除Ldh活性来消除哺乳动物细胞中的Warburg效应是可行的。而先前的研究表明，CHO细胞中的Ldha是必要的，，作者发现它在CHO细胞中的重要性是由于它参与了一个具有负反馈回路的调节回路，如果同时删除多个基因，这个电路可以被移除，而没有任何明显的负面影响。因此，这突出了当揭示它们的系统级背景时，看似必要但不是预期的特征，而多重基因组编辑策略和组合基因组编辑筛选在这类研究中特别重要。

原文：Hefzi, H., Martínez-Monge, I., Marin de Mas, I., Cowie, N. L., Toledo, A. G., Noh, S. M., Karottki, K. J. C., Decker, M., Arnsdorf, J., Camacho-Zaragoza, J. M., Kol, S., Schoffelen, S., Pristovšek, N., Hansen, A. H., Miguez, A. A., Bjorn, S. P., Brøndum, K. K., Javidi, E. M., Jensen, K. L., Stangl, L., … Lewis, N. E. (2024). Multiplex genome editing eliminates the Warburg Effect without impacting growth rate in mammalian cells. bioRxiv : the preprint server for biology, 2024.08.02.606284. https://doi.org/10.1101/2024.08.02.606284