瞬时稳定工程哺乳动物细胞的降解瓶颈和资源竞争

降解标签，也被称为degrons，是一种可用于改变蛋白质稳定性的便携式序列。英国伦敦帝国理工学院化学工程系的研究团队在国际顶级期刊《Nature communications》上在线发表了研究-“Degradation bottlenecks and resource competition in transiently and stably engineered mammalian cells”。作者报道了在工程哺乳动物细胞中，降解蛋白竞争细胞降解资源，当采用构成型靶向的人类降解蛋白时，导致其他独立表达蛋白的降解率耦合。这种竞争的影响取决于环境的背景。通过考虑不同的蛋白质、degron位置和细胞宿主，强调了degron对降解强度和资源耦合的影响如何变化，并确定了正交组合。通过采用可诱导的细菌和植物降解方法，还强调了如何实现合成结构降解的控制解耦。然后，作者构建了一个标记有不同差异基因的基因组集成能力监测器，并确认了基因组和瞬时表达的DNA构建物之间的资源竞争。这项工作将工程哺乳动物细胞中资源竞争的特征扩展到蛋白质降解，还包括集成系统，为优化异源表达系统提供了一个框架，以推进基础和应用生物学研究的应用。

关键发现：

1、 对降解资源的竞争影响了哺乳动物的表达系统

图1 通过容量监测器探测退化诱导的耦合

容量监测器以前已被用于量化和可视化细菌和哺乳动物细胞中的基因表达资源竞争。监测器是荧光表达盒，作为细胞宿主内可用基因表达能力的代理。当与共表达的测试结构结合使用时，监视器的表达水平的变化可以被认为是该给定结构的资源占用的半定量代理度量。调查是否降解资源的竞争也影响哺乳动物异源表达，作者设计了一个实验的宠物标记能力监测，设计通过将宠物降解域的荧光读出瞬时表达监控（mKate），共转染与标记或未标记EGFP表达测试结构，并进行了一个并行控制实验，mKate监视器不标记降解（图1）。所有的构建物都共享相同的质粒主干、启动子、Kozak序列和polyA信号。它们之间唯一的区别是存在或不存在行为域。

2、 识别特定降解资源瓶颈的降解库

图2 B三个共转染容量监测器的特征库

一旦证实作者可以采用瞬态监测器来跟踪哺乳动物细胞中降解资源的竞争，作者设计了一套瞬态容量监测器和测试结构，使作者能够评估和表征不同降解域的资源足迹。作者考虑了n端和c端的退化能力，根据它们先前的特征。因此，作者设计了一个7个EGFP表达结构库（UbVR、2xUbAV、UbR、UbM、EGFP、PEST和一个N端UbVR和C端PEST的复合结构）。

3、可诱导降解域的测试

图3 在哺乳动物细胞中测试细菌和植物的偶合

可诱导的降解剂可以用来在添加一种化学物质时触发蛋白质降解。它们的快速动态和易于通过细胞渗透性小分子控制，导致诱导原原蛋白在合成生物学和细胞治疗中被用作蛋白质调节的调谐表盘。在这里，作者测试了两个常用的诱导降解域，mAID2，生长素诱导的细胞和ecDHFR-DD，甲氧苄啶（TMP）诱导的细胞，对共转染的ubvr标记容量监测器的影响。这两个结构域都融合到EGFP的N端，类似于UbVR，也位于N端。虽然这两个系统都允许对一个感兴趣的蛋白质的稳定性进行可诱导的控制，但它们确实有显著的差异。大肠杆菌二氢叶酸还原酶蛋白（ecDHFR）是一个45kda易于降解的结构域，通过引入小分子抗生素TMP22而稳定（图3A）。作者克隆了一个含有DHFR-EGFP融合蛋白的质粒，并将其与作者的UbVR-mKate容量监测器设计共转染。

4、对基因表达和降解资源的竞争影响着基因组整合的基因

图4 转染基因和整合基因之间的资源竞争和降解耦合

为了研究对降解资源的竞争是否会影响整合合成盒的行为，作者在HEK293T中构建了一个容量监测细胞系。为了实现对从转录到降解的资源摄取的快速、敏感和可控的响应，终止子设计了一种可诱导并携带N端和c端降解标签的监测器。作者克隆了一个结构，在强力霉素诱导下，TET启动子（TETp）49驱动三个mCherry基因融合在一起，并分别与N端和C端降解域UbVR和PEST相连。作者将HEK293T细胞的AAVS1位点与CRISPR-Cas9单质粒进行整合。选择了一个克隆进行进一步的实验，因为它显示了正确的PCR基因分型谱和在诱导剂存在的情况下预期的诱导行为。

结论

总的来说，在未来，蛋白质降解的瓶颈可以在合成生物学中被利用，以改进利用降解蛋白的基因电路的上下文感知设计，或诱导降解竞争作为合成调控的一种手段。为治疗目的，竞争降解可以用来控制特定的蛋白质降解途径和稳定细胞蛋白质的失调降解导致人类疾病超过当前蛋白酶体抑制剂的毒性挑战或优化PROTACs的多路复用或分子胶，因为他们依赖内源性降解途径。作者的数据强调了上下文依赖性，特别是蛋白质和细胞宿主环境以及标记蛋白在标记蛋白上的位置，如何在形成竞争谱和多个哺乳动物标记蛋白的活性中发挥关键作用。他们还确定了在资源使用中具有改进的正交性的设计，使它们易于使用具有多个degron标记蛋白质的合成系统。因此，研究结果强调了在考虑哺乳动物细胞中基因表达资源竞争的影响时，必须采取更全面的方法，包括考虑其他调控途径，如蛋白质降解和分泌资源。这种全面的方法对于揭示被异源基因表达破坏时复杂的细胞调控至关重要，并可能对生物技术和合成生物学领域具有广泛的影响。

原文：Gabrielli, J., Di Blasi, R., Kontoravdi, C., & Ceroni, F. (2025). Degradation bottlenecks and resource competition in transiently and stably engineered mammalian cells. Nature communications, 16(1), 328. https://doi.org/10.1038/s41467-024-55311-w