微流控电化学系统实现嗜肺军团菌的实时监测

目前，检测嗜肺军团菌的“金标准”是细菌培养法，但耗时长达10天，且依赖专业操作。其他方法如PCR和免疫检测虽快速，但需复杂设备或无法覆盖多种血清型。因此，开发一种快速、灵敏、适用于现场监测的技术迫在眉睫。近日，McMaster University的李应福（Yingfu Li）教授团队开发了一种名为L.DNAlyzer的检测系统（图1），他们采用RNA切割型脱氧核酶直接在冷却塔水的单个样品中连续实时监测嗜肺军团菌，在病原菌存在时，RCD发挥作用，释放电活性的DNA条形码（DNA  DNA barcode），之后此条码被下游的电化学传感器进行实时检测，检出限为1.9×10³ CFU/mL，并且可以识别不同血清型的嗜肺军团菌，为此类高风险病原体提供了一种高度特异性的检测公爵，接下来让我们对这项工作进行解密。

图1 L.DNAlyzer检测系统的构造及原理简图

技术原理：DNAzyme与电化学的完美结合

1. DNAzyme的靶向识别

RCDs是一种功能性核酸分子，可编程识别嗜肺军团菌的特异性蛋白。当目标细菌存在时，RCDs切割释放带有亚甲蓝标记的单链DNA（e-barcode）。

2. 微流控与电化学检测

- 生物识别区：微凝胶磁珠（mMB）固定RCDs，通过磁铁定位，形成连续流动反应界面。

- 检测区：纳米结构电极表面修饰互补DNA探针，捕获e-barcode后，通过方波伏安法（SWV）检测亚甲蓝的还原电流（图1）。

实验优化：从设计到性能提升

1. 电极设计优化

团队对比了双电极与三电极系统，发现三电极（工作电极、对电极、参比电极）结合纳米结构金电极可显著提升信号灵敏度。纳米结构使电极表面积增加5倍，电子转移速率提高至102 s⁻¹（平面电极仅为60.2 s⁻¹）（图2）。 

图2 纳米电极与平面电极性能对比。（左）纳米电极（b）与平面电极（a）的扫面电镜对比；（右）纳米电极（ii）与平面电极（i）的动力学对比

2. 流量与反应动力学

通过测试不同流速（0-300 μL/min），发现100 μL/min时信号响应最佳：滞后时间最短（6分钟），线性斜率最高（图3）。流速过高（300 μL/min）会导致边界层剪切力破坏DNAzyme结构，降低效率。

图3 不同流速下的电流动力学曲线，100 μL/min时信号响应最稳定。

性能验证：灵敏度、特异性与实际应用

1. 检测限（LOD）

在缓冲液中，L.DNAlyzer的检测限为1.4×10³ CFU/mL；在真实冷却塔水样中为9×10³ CFU/mL，完全满足CDC对冷却塔水监测的要求（>10³ CFU/mL）（图4）。 

图4 L.DNAlyzer的LOD

2. 特异性测试

系统可区分嗜肺军团菌与其他水生病原体（如大肠杆菌、铜绿假单胞菌），且能识别不同血清型（如血清型1、2、3）。非肺炎军团菌（Legionella non-pneumophila）的响应信号可忽略（图5）。

图5 .DNAlyzer鉴定嗜肺军团菌的能力

3. 实际水样测试

团队分析了7种冷却塔分离菌株，结果显示系统能快速识别所有嗜肺军团菌血清型（6分钟内信号上升），而其他菌株信号与空白对照无差异。 

L.DNAlyzer的诞生标志着环境病原体监测技术的重大进步。其快速、灵敏、自动化的特点，为冷却塔水安全管理提供了高效工具，有望在全球范围内降低军团病暴发风险。

 文章来源：《Biosensors and Bioelectronics》(IF=10.7)

DOI: https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.11728