CRISPR/Cas12a新应用：25分钟快速检测白菜四大病害

芸薹属植物（Brassica）包括白菜、油菜等是我国重要的经济作物之一，但其生产常受霜霉病、黄萎病、黑腐病和根肿病四种病害的威胁。这些病害由不同病原体引起，具有传播快、危害大的特点，尤其在气候变化和种植模式改变的背景下，田间早期诊断成为防控关键。传统检测方法如PCR、实时荧光定量PCR等虽灵敏，但依赖昂贵设备，难以在田间普及；而等温扩增技术（如RPA、LAMP）虽便携，但灵敏度不足。北京市农林科学院国家重点实验室于拴仓等基于CRISPR/Cas12a开发了一款多通道侧流生物传感器（4LFB）平台——CasAIRPA，可在25分钟内完成四种不同病原体导致的病害（霜霉病、黄萎病、黑腐病、根肿病）的同步检测（图1）。

图1 CasAIRPA平台的设计

原理解读

CRISPR/Cas核酸酶的反式切割活性助力了检测不同作物中的各种病原体的新方法的开发，其中核酸检测中最为广泛应用的是II型CRISPR/Cas系统，包括V型Cas12和VI型Cas13。当存在靶核酸时，CRISPR RNA (crRNA) 与靶序列特异性结合，激活Cas12 或 Cas13 的反式切割活性，导致ssDNA 或ssRNA 探针被切割。

此检测平台，主要分为以下三步：Step1，提取待测蔬菜的DNA（快速裂解提取，仅需5 min）；Step2，使用提取得到的DNA进行RPA反应扩增，在37 ℃下15 min形成扩增产物；Step3，使用便携式四通道侧向层析生物传感器（4-LFB）监测。

关键优化

1. CRISPR/Cas12a系统的优化

CRISPR/Cas12a以其高特异性和“反式切割活性”成为检测利器。当crRNA与靶标DNA结合后，Cas12a被激活，可非特异性切割单链DNA探针（图1）。然而，crRNA的二级结构稳定性直接影响检测灵敏度。所以为提高传感器检测性能，研究人员进行了以下优化：

- crRNA结构设计：通过RNA fold软件预测16种crRNA的二级结构，筛选出自由能（ΔG）最低的稳定结构（图2）。例如，黑腐病检测的crRNA（B21）ΔG值低至16.30 kcal/mol，显著提升灵敏度。

图2 crRNA结构的优化

- 探针与反应体系：优化Cas12a、crRNA和ssDNA探针的浓度比（50 nM:50 nM:500 nM），并确定15分钟为最佳反应时间（图3）。

图3 Cas12a、crRNA和ssDNA浓度的优化

2. 四通道侧流生物传感器（4-LFB）的设计

传统侧流试纸条仅支持单病原检测，本研究创新性地开发了四通道试纸条（图4a），每条通道对应一种病害。试纸条包含：

- 检测线（T线）：包被生物素BSA，捕获带有生物素的探针。

- 对照线（C线）：包被抗FITC抗体，结合FITC标记的探针。 

检测原理：

- 阳性样本：Cas12a切割探针后，SAGNPs（链霉亲和素金纳米颗粒）仅结合T线，显示红色条带（图4b）。 

- 阴性样本：未切割的探针同时结合T线和C线，显示双红带（图4d）。 

图4 用于检测四种病原体的LFB检测方法是设计原理及灵敏度

 效果检验

1. 灵敏度与特异性 

- 黑腐病检测限0.0015 ng/μl，霜霉病和根肿病0.015 ng/μl，黄萎病0.15 ng/μl（图4e）。

- 特异性验证：仅靶标病原体可激活Cas12a，非靶标无交叉反应（图5）。 

图5 CasAIRPA的特异性

2. 25分钟完成田间检测 

在北京蔬菜研究中心的田间试验中，15份样本检测结果显示，黄萎病感染率最高（14/15），黑腐病和根肿病各12例，霜霉病10例（图6a），与RTqPCR结果完全一致（图6b）。

图6 现场检测实际样本

CasAIRPA可直接应用于田间，帮助农民快速识别病害，及时采取防治措施，减少经济损失。此外，该技术可扩展至其他作物病害检测，如水稻、小麦等。并且研究人员开发了一款疾病特异性二维码（图1），可以通过手机扫描获取基本信息、疾病特征、病原体、疾病症状照片、检测点的crRNA序列及病原体的rDNA-ITS序列，更加丰富了检测系统的实际体验。为植物病害检测提供了高效、低成本的解决方案。

 参考文献： 《Horticulture Research》(IF: 7.6)，Doi: 10.1093/hr/uhae35