受Kiwi启发的Rational纳米结构，具有增强和离散的磁荧光功能，用于超灵敏即时免疫测定

1.引言

心肌生物标志物的识别，尤其是心肌肌钙蛋白I（cTnI），是急性心肌梗死（AMI）诊断的可靠方法，cTnI被认为是金标准，其阈值为40pgmL⁻¹，并可在症状出现后3小时内检测到。然而，cTnI的临床检测通常依赖于化学发光免疫测定，这需要专门设备和技术人员，使其在紧急情况下不够实用。因此，开发即时护理（POC）检测方法以便患者能够及时监测cTnI显得尤为重要。侧流免疫测定法（LFIA）因其经济、便携和快速的特点在POC免疫诊断中广受关注，但传统LFIA在灵敏度上存在限制。为提高LFIA的灵敏度，研究者们尝试使用金纳米颗粒、荧光标记等方法，但仍面临样品基质干扰和免疫反应动力学不足的问题。量子点和Fe₃O₄纳米颗粒常被用作磁荧光双功能结构的组成部分，但在共组装过程中可能会导致量子点荧光猝灭。

基于此，本研究报道了一种采用空间分离组装策略的猕猴桃型磁荧光二氧化硅纳米杂化物（称为MFS）。该方法利用具有强磁响应的Fe₃O₄纳米颗粒簇，表面涂有树突状SiO₂(dSiO₂)，作为具有大比表面积的模板，用于高密度和受控的量子点组装。如图1b所示，MFS通过Fe₃O₄纳米颗粒的内部聚类实现了高水平的磁性，同时还通过在内皮纤维状dSiO₂上组装丰富的量子点来确保强大的荧光强度。值得注意的是，通过纳米结构的空间分离，磁性成分对荧光信号的猝灭影响得到了缓解。最外层，类似于肉状二氧化硅，确保高胶体稳定性，并允许多功能的表面功能化。抗体偶联后，新型磁荧光胶体作为磁富集和荧光信号放大标记，用于实际血清样品中cTnI的超灵敏POC检测。

方案1.常规a型和kiwi型b型磁荧光组件设计策略示意图

2.结果与讨论

kiwi型MFS纳米结构的合成与表征

研究者通过溶剂热法合成了平均直径约为200nm的Fe₃O₄颗粒，并在其表面生长了一层厚约82nm的二氧化硅（dSiO₂）层。所得的Fe₃O₄@dSiO₂粒子具有约30nm的孔道宽度，为量子点的结合提供了空间。随后，研究者通过硫-金属配位将8nm的疏水量子点固定在dSiO₂表面，形成Fe₃O₄@dSiO₂@量子点纳米球。经过相转移硅烷化和外部硅壳膨胀处理，最终得到Fe₃O₄@dSiO₂@QDs@SiO₂球，命名为MFS。大尺度SEM图像显示MFS微球具有良好的均匀性，透射电子显微镜（TEM）和能量色散X射线能谱（EDS）进一步证实了Fe₃O₄在MFS中的中心性及量子点的密集分布。

图1.Fe₃O₄,Fe₃O₄@dSiO₂，Fe₃O₄@dSiO₂@QDs和MFS的SEM（a−d）和TEM（e−h）图像。i)单个MFS的STEM图像。j−i)单个Fe₃O₄@dSiO₂，Fe₃O₄@dSiO₂@QDs和MFS的截面TEM图像，切片厚度为70nm。红色箭头表示树枝状孔隙通道的位置。m)单个MFS纳米球的EDS元素映射图像（m₁−m₇）。

通过氮吸附-解吸等温线分析了MFS合成过程中孔隙结构的变化，发现Fe₃O₄@dSiO₂颗粒具有较大的BET面积和孔隙体积，加载量子点后显著减小，最终MFS的孔隙结构被完全密封。水接触角（WCA）测量表明，量子点的固定增加了疏水性，而后续的二氧化硅涂层又恢复了亲水性。FTIR光谱证实了(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的成功修饰和量子点的加载。X射线粉末衍射图显示Fe₃O₄和量子点在MFS中均保持了完好的晶体结构。流体动力直径（HD）和zeta电位测量表明MFS-COOH在水溶液中具有良好的胶体分散性。MFS的光学性质接近纯量子点，磁滞回线呈现超顺磁性，且MFS-COOH具有良好的光学稳定性和胶体稳定性，显示出其在生物标记方面的潜力。

图2. kiwi型MFS纳米结构的合成与表征

MFS胶体的荧光信号放大验证

研究者通过氮吸附-解吸等温线分析了MFS合成过程中孔隙结构的变化，发现Fe₃O₄@dSiO₂颗粒具有较大的BET面积和孔隙体积，加载量子点后显著减小，最终MFS的孔隙结构被完全密封。水接触角（WCA）测量表明，量子点的固定增加了疏水性，而后续的二氧化硅涂层又恢复了亲水性。FTIR光谱证实了(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的成功修饰和量子点的加载。X射线粉末衍射图显示Fe₃O₄和量子点在MFS中均保持了完好的晶体结构。流体动力直径（HD）和zeta电位测量表明MFS-COOH在水溶液中具有良好的胶体分散性。MFS的光学性质接近纯量子点，磁滞回线呈现超顺磁性，且MFS-COOH具有良好的光学稳定性和胶体稳定性，显示出其在生物标记方面的潜力。

图3.MFS胶体的荧光信号放大验证

MFS-FLFIA的样品放大和降噪验证

研究者评估了MFS在不同生理介质中的磁捕获能力，并通过碳二亚胺交联反应将抗cTnI单克隆抗体共价修饰到MFS上，形成MFS-mAb1。基于MFS的荧光侧流免疫分析（MFS-FLFIA）用于检测cTnI。首先，将含cTnI的血清样品与MFS-mAb1孵育以促进免疫反应，然后通过磁性支架富集免疫复合物。在阳性实验中，MFS-mAb1-cTnI被抗cTnImAb2捕获，形成三明治免疫复合物，同时剩余的MFS-mAb1通过C线进行验证。MFS-FLFIA条带可视化定性鉴定cTnI，并使用智能手机分析仪进行定量分析。

图4.MFS-FLFIA检测cTnI的示意图

在对MFS-FLFIA进行样品放大和降噪验证之前，研究者优化了检测条件。随着目标cTnI浓度的升高，T线的荧光强度逐渐增加，范围从0到50ngmL⁻¹。预浓缩5倍和30倍的样品在0.1和0.01ngmL⁻¹条件下均可检测到T线，而未富集的样品在0.5ngmL⁻¹条件下可检测到。磁性操作的MFS-FLFIA显示出较低的可见检出限（LOD），且样品富集效率在5倍和30倍预富集时分别为100%和66.67%。比较磁分离前后的信噪比（S/N），结果表明MFS在复杂矩阵中有效降低了噪音，信噪比从1.81增加到5.55，证明了其在cTnI检测中的有效性。

图5.MFS在复杂矩阵cTnI检测中降噪的有效性

MFS-FLFIA检测血清中cTnI

受MFS优异的光学和磁性特性启发，研究者设计了高灵敏度的FLFIA试纸条用于检测胎牛血清中的cTnI。扫描电镜分析确认了颗粒定位，当cTnI浓度为50ngmL⁻¹时，T线区域出现丰富的MFS-mAb1颗粒。荧光信号随着cTnI浓度增加而增强，检测限为0.025ngmL⁻¹，样品富集30倍。MFS-FLFIA的灵敏度优于传统方法，并且在不同浓度下显示出良好的线性关系。该试纸条在特异性检测方面表现出色，对心脏标志物具有良好的区分能力，并且在室温下可保存4周，适合低资源环境应用。

图6.MFS-FLFIA检测血清中cTnI

MFS-FLFIA检测cTnI的真实样品

研究者使用MFS-FLFIA试纸条检测临床血清样品中的cTnI，并将结果与商业化学发光免疫分析法（CLIA）进行相关性分析，在0.03~4.571ngmL⁻¹范围内建立了良好的线性关系（R2=0.998）。Bland-Altman图显示两种定量方法之间具有一致性。MFS-FLFIA和CLIA在对照组和患者血清中cTnI水平差异不显著。受试者工作特征（ROC）曲线分析显示曲线下综合面积（AUC）值为1，表明该方法对阳性和阴性样品组的识别效果很好，验证了MFS-FLFIA试纸条可直接分析临床血清样品。

图7.MFS-FLFIA试纸条可直接分析临床血清样品中的cTnI水平

 3.总结

本研究设计了一种超灵敏的FLFIA平台，利用猕猴桃型磁荧光二氧化硅纳米杂化物（MFS）作为靶富集底物和光信号增强标签。该结构具有层次分明的特征，包括Fe₃O₄核心、树突状介孔二氧化硅、量子点和二氧化硅基质，使其具备高荧光亮度、快速磁响应及良好的水中分散性。通过液相捕获和荧光信号放大，以及磁富集和降噪，MFS-FLFIA成功应用于心肌肌钙蛋白I的检测，其检测限为8.4pgmL⁻¹，远低于以往的荧光和比色方法。这项研究为LFIA平台上磁荧光信号放大的策略提供了新思路，展示了其在生物标志物高灵敏度快速检测中的广阔前景。

论文链接：https://doi.org/10.1002/smll.202402676