微流控技术革新：单层荧光计数法助力早期癌症诊断

细胞外囊泡（EVs）是细胞在正常和病理状态下分泌的纳米级膜囊泡，携带多种功能分子（如核酸和蛋白质），可作为非侵入性肿瘤生物标志物。然而，传统检测方法（如西方印迹和ELISA）灵敏度有限，难以检测早期肿瘤中的低浓度EVs。因此，开发高灵敏度的EVs检测方法对于早期癌症诊断至关重要。

近期，武汉纺织大学化学与化工学院的研究团队设计了一种单层荧光计数策略，通过免疫磁性微珠（IMBs）特异性捕获并分离复杂基质中的EVs，利用增强型声波微流控通道实现磁性-EVs免疫复合物与抗体修饰的荧光微珠（IFBs）的充分混合和反应。新型阶梯楔形微流控结构能够大量捕获微米级颗粒，并以单层形式排列，减少流体阻力，从而实现超灵敏检测。该方法的检测限低至850个颗粒/毫升，具有高可靠性和特异性。

研究结果

图 1 基于阶梯楔形微流控芯片的肿瘤细胞衍生细胞外囊泡超灵敏检测的单层荧光计数法

此次研究提出的新策略，借助免疫磁珠从复杂基质中特异性捕获和分离细胞外囊泡，再利用增强声波微流控通道，使磁珠-细胞外囊泡免疫复合物与抗体修饰的荧光微珠充分混合并反应。如图1，创新设计的阶梯楔形微流控结构，可让微米级颗粒在阶梯区域大量单层捕获，楔形结构还能降低流体阻力。通过计数荧光标记免疫夹心复合物的检测信号，避免背景干扰，检测限低至850颗粒/毫升，在临床样本检测中展现出高可靠性和特异性。此外，基于该微流控平台开发的小型化检测装置，提高了检测自动化程度。

图 2 微流控平台上的整个分析流程

在实验过程中，研究人员详细描述了声波微流控芯片、阶梯楔形微流控芯片的制备方法，以及免疫磁珠、免疫荧光珠的修饰步骤等。通过对免疫荧光珠和免疫磁珠的表征，证实了抗体成功修饰；对声波辅助微流控混合的研究，确定了最佳频率和高效的混合效果；在阶梯楔形微流控芯片上实现了单层微珠捕获；对超灵敏检测的研究，明确了检测方法的灵敏度、动态范围和检测限。

图 3 免疫磁性微珠（IMBs）的制备原理及表征结果

与其他细胞外囊泡检测方法相比，该单层荧光计数策略优势明显。从图3A可清晰看到免疫磁珠（IMBs）和免疫荧光珠（IFBs）的生成原理，通过化学交联法将抗体修饰到磁性微珠和荧光微珠表面，制备IMBs和IFBs。图3B展示的zeta电位变化表明抗体成功修饰到免疫荧光珠上，图3C-E显微镜图像直观呈现了IMBs修饰后的效果，有力证明了该方法的可行性。

图 4 声波微流控芯片的设计原理和混合效果

图4A呈现了声波产生和混合的原理，图4B展示不同频率条件下的荧光强度，图4C，D则是微通道在开关前后的荧光图像。这些图像数据描述了声波微流控芯片的设计原理和混合效果，通过荧光强度测量和显微镜图像展示了声波辅助混合的高效性。表明该方法能有效实现微流控混合，为后续检测反应提供保障。

图 5 阶梯楔形微流控芯片的设计和单层微珠捕获效果

如上图，图5A是阶梯楔形微流控设计示意图，图5B为微珠单层排列示意图，图5C，D分别是阶梯楔形微流控芯片和单层微珠的显微镜图片，清晰展示了微珠在芯片上的捕获和排列情况，为信号读取提供了良好基础。该结构能够实现大量微珠的单层排列，减少流体阻力。

研究人员将细胞外囊泡（EVs）稀释至0到10⁸个/mL，通过TEM和NTA进行表征和浓度测定。在阶梯楔形微流控芯片中，免疫夹心复合物以单层排列。荧光显微镜观察到荧光点数随EVs浓度增加而增多。在10³-10⁷个/mL浓度范围内，荧光点数与浓度呈良好线性关系（R²=0.99）。但10⁸个/mL时，过多荧光点干扰计数，线性关系变差。该方法检测限低至550个/mL，灵敏度极高。

为了进一步探究该检测方法的可靠性和特异性，研究人员用该方法检测了口腔癌患者和健康人的唾液样本。结果显示，口腔癌样本的荧光点明显多于健康样本，二者差异显著（P=0.0011）。这表明该方法能准确区分癌症患者和健康人，具有良好的可靠性和特异性。

与其他细胞外囊泡检测方法相比，该单层荧光计数策略优势显著。其通过创新的微流控结构设计和检测方式，有效去除背景信号干扰，提高了检测的准确性和灵敏度。同时，阶梯楔形微流控芯片使得大量微珠能够单层排列，不仅提升了计数的准确性，还缩短了分析时间，展现出良好的商业应用潜力。

这一研究成果为疾病早期诊断提供了一种超灵敏的检测手段，有望在未来临床实践中发挥重要作用，为癌症患者的早期发现和治疗争取宝贵时间。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.136786