细菌表面纳米涂层作为开发生物疗法的多功能平台

摘要

细菌因其独特的特性，如遗传可操作性、快速增殖和对靶向疾病部位的特异性，已被广泛用作活体治疗剂。然而，各种体内损伤会降低给药细菌的活力，导致整体生物利用度较低。此外，细菌表面的固有抗原以及释放的毒素和代谢物可能会引起不良的安全问题。这些限制阻碍了活体细菌治疗剂的临床转化。最近，我们开发了一种多功能平台，通过化学修饰或物理包封对细菌进行纳米涂层，制备先进的活体细菌治疗剂，提高生物利用度并减少副作用，从而增强微生物治疗效果。在此，利用界面自组装制备了脂质膜包被的细菌（LCB），表现出对各种恶劣环境条件的增强抵抗力。同时，应用机械挤出法生成了细胞膜包被的细菌（CMCB），显示出改善的生物相容性。文章详细描述了这些包被细菌的制备过程，并展示了其预期功能。文章还表明，在小鼠模型中，通过口服给药和静脉注射后，LCB和CMCB分别在治疗结肠炎和肿瘤方面表现出良好的潜力。

引言

近年来，关于人类微生物群与健康之间关系的研究为细菌治疗开辟了新的视野，因为细菌可以调节宿主的多种生理功能。细菌占微生物群的 99% 以上，广泛存在于人体内外，包括皮肤、胃肠道、呼吸道和生殖道，对我们的健康至关重要。细菌不仅在免疫调节和稳态维持方面发挥有益作用，还能靶向并定植于体内的特定生物界面。因此，细菌已被广泛用作治疗剂或药物载体。例如，自 19 世纪末以来，由于在肿瘤中的积累和增殖以及对肿瘤细胞的抑制作用，天然细菌及其衍生物已成为有吸引力的抗肿瘤治疗剂。后来，为了提高治疗效果，包括 Escherichia coli Nissle 1917 (EcN)、Lactococcus lactis 在内的益生菌以及包括 Clostridium difficile 和 Salmonella typhimurium 在内的致病菌已被基因工程改造，以产生有毒蛋白和/或小分子药物，并广泛用作药物载体，将治疗剂递送至肿瘤。同样，通过口服给药，从天然和基因工程细菌开发的细菌治疗剂已被用于疾病治疗。近年来，细菌治疗剂在多种疾病的诊断和治疗中，特别是在癌症和胃肠道疾病中，展现出了有希望的临床应用前景和转化价值，因为许多细菌已在 I/II 期临床试验中得到测试。然而，细菌在体内的使用面临几个挑战，包括快速免疫清除、生物利用度不足、剂量依赖的副作用和不受控制的定植。因此，迫切需要开发具有可控生物功能的优质活体细菌治疗剂，以实现高级治疗。                 

图1. 用于强化处理的表面包被细菌的制备和应用示意图。

实验结果

一、表面纳米涂层细菌的制备与表征

文章详细介绍了两种表面纳米涂层细菌的制备方法：脂质体涂层细菌（LCB）和细胞膜涂层细菌（CMCB）。LCB 是通过化学修饰，利用钙离子引导的界面自组装方法制备的，而 CMCB 是通过物理挤出法将红细胞膜包裹在细菌表面制备的。透射电镜（TEM）成像显示，LCB 和 CMCB 的表面均形成了清晰的外层壳，与未涂层细菌相比有明显区别。流式细胞术分析和激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）成像进一步证实了涂层的存在。此外，动态光散射（DLS）测量显示涂层细菌的粒径和电位发生了变化，表明纳米涂层的成功包裹。

二、体外评价

（一）细菌生长与活性

体外实验表明，LCB 和 CMCB 的生长曲线与未涂层细菌相似，表明纳米涂层对细菌生长无明显影响。细胞活性实验也显示涂层细菌与未涂层细菌具有相似的活性，说明纳米涂层未对细菌的生理活性产生负面影响。

（二）耐受性

LCB 和 CMCB 对多种恶劣环境表现出增强的耐受性。例如，在含有抗生素、强酸、强碱以及乙醇的环境中，涂层细菌的存活率显著高于未涂层细菌。通过TEM观察发现，纳米涂层能够在这些不利环境中有效保护细菌的完整性。

三、体内评价

（一）LCB 的体内评价

在小鼠体内，LCB 显示出增强的胃肠道保留能力。通过活体成像系统（IVIS）观察到，LCB 在口服后4小时在胃肠道中的存活率明显高于未涂层细菌。此外，对LCB在DSS诱导的结肠炎模型和STm感染诱导的结肠炎模型中的治疗效果进行了评估。结果显示，LCB能够有效维持肠道重量和长度，减轻肠道炎症，降低炎症因子水平，如IL-6和IFNγ。

（二）CMCB 的体内评价

CMCB 在体内表现出增强的血液保留能力和肿瘤靶向性。尾静脉注射CMCB后，其在血液中的保留时间显著长于未涂层细菌。此外，CMCB能够快速且高效地积累在肿瘤组织中，并在12天内持续增加。相比之下，未涂层细菌在健康器官中的数量随时间显著减少。通过活体成像和细菌计数进一步证实了CMCB在肿瘤组织中的高效积累。同时，CMCB处理组小鼠的肿瘤相关细胞因子水平显著高于未涂层细菌处理组，表明CMCB在肿瘤治疗中具有更大的潜力。

四、安全性评估

对CMCB的生物安全性进行了评估。通过常规血液检测和细胞因子检测发现，CMCB处理组小鼠的白细胞、红细胞和血小板计数更接近于未处理小鼠，而未涂层细菌处理组小鼠的这些指标变化较大。此外，CMCB处理组小鼠的炎症因子水平较低，表明红细胞膜涂层能够降低体内免疫清除，减少炎症反应，提高生物安全性。

结论

总之，研究者开发了一种多功能平台，通过化学修饰或物理包封对细菌进行纳米涂层，制备先进的活体细菌治疗剂。LCB 和 CMCB 提高了生物利用度并减少了副作用，分别在治疗结肠炎和肿瘤方面展现出良好的潜力。这种表面纳米涂层技术提供了一种方便且多功能的方法，可以在不受细菌菌株类型限制的情况下引入功能成分，确保了令人满意的生物相容性和安全性。未来的工作将重点优化涂层工艺，并探索这些包被细菌的临床应用。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41596-024-01019-6