基于LAMP-CRISPR/Cas12a的大肠杆菌O157:H7高灵敏检测技术

原创

来源：蔡伟程

2025-03-27 17:07:36

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核心提示：研究人员构建了一种针对大肠杆菌O157:H7的LAMP-CRISPR/Cas12a快速检测方法，该方法以实验室筛选出的Ecs_2840基因为特异性靶基因，通过优化LAMP反应和Cas12a反式切割反应条件，实现了对大肠杆菌O157:H7的高灵敏度和特异性检测。

近年来，食品安全问题一直是全球关注的焦点。其中，由致病性大肠杆菌O157:H7引发的食源性疾病更是频繁见诸报端。这种细菌主要通过污染的食物传播，如生牛奶、牛肉等，感染后可导致腹泻、出血性结肠炎，严重时还会引发溶血性尿毒综合征，危及生命。据世界卫生组织统计，每年约有6亿人因食用受污染食品而生病，其中近42万人死亡，大肠杆菌O157:H7便是罪魁祸首之一。因此，建立一种快速、准确的检测方法，以便在食品生产、加工和销售环节及时发现并控制这种病菌的污染，显得尤为重要。

传统检测方法的局限性

传统的检测大肠杆菌O157:H7的方法主要依赖于细菌培养，这种方法需要经过细菌富集、分离、生化实验和血清型鉴定等多个步骤，通常需要3至4天才能完成一次检测，不仅过程繁琐，而且耗时较长，难以满足快速检测的需求。而聚合酶链式反应（PCR）和环介导等温扩增（LAMP）等分子检测技术虽然能够在一定程度上提高检测速度，但PCR需要专业的检测设备，难以在资源有限的地区使用；LAMP虽然操作相对简单，但容易出现引物二聚体化现象，导致检测灵敏度降低，且在扩增过程中容易产生气溶胶污染，引发假阳性结果，影响检测的准确性，这些都限制了它们在实际应用中的广泛推广。

LAMP-CRISPR/Cas12a技术的突破

在这样的背景下，一种结合了环介导等温扩增（LAMP）和CRISPR/Cas12a系统的新型检测技术应运而生。CRISPR/Cas12a是一种广泛存在于古菌和细菌中的获得性适应性免疫系统，Cas12a蛋白能够在crRNA（CRISPR RNA）的引导下特异性识别并切割含有特定PAM序列的双链DNA，激活其非特异性反式切割活性，进而切割系统中的单链DNA探针，产生可被仪器检测到的荧光信号，从而实现对目标DNA的检测。基于这一原理，研究人员构建了一种针对大肠杆菌O157:H7的LAMP-CRISPR/Cas12a快速检测方法，该方法以实验室筛选出的Ecs_2840基因为特异性靶基因，通过优化LAMP反应和Cas12a反式切割反应条件，实现了对大肠杆菌O157:H7的高灵敏度和特异性检测。

图1 用于检测大肠杆菌O157:H7的LAMP-CRISPR/Cas12a一管法检测系统示意图。

检测技术的优势与创新

这种新型检测技术具有诸多显著优势。首先，其灵敏度极高，在纯培养条件下能够稳定检测到低至9.2×10⁰ CFU/mL的大肠杆菌O157:H7，且整个反应过程仅需1小时。

图2 LAMP-CRISPR/Cas12a系统的灵敏度评估。A-a：两步法：紫外灯下的颜色变化；A-b：两步法：荧光曲线；B-a：一管法检测：紫外灯下的颜色变化；A-b：一管法检测：荧光曲线。（关于本图注中颜色引用的解释，请读者查阅本文的网络版本。）

在实际应用中，对于牛奶样本，初始污染量为7.4×10⁰ CFU/mL的大肠杆菌O157:H7在经过3小时培养后即可被检测出来。其次，该方法的特异性极强，能够准确区分大肠杆菌O157:H7与其他常见食源性病原菌，检测结果不受其他细菌的干扰。

表1 LAMP-CRISPR/Cas12a系统的人工污染检测试验

注：“+”表示检测到；“-”表示未检测到。“/”左边表示两步法，右边表示一管法检测。

此外，该技术还创新性地构建了一种“一管法”检测体系，将LAMP扩增和Cas12a切割反应集成在一个试管中进行，避免了开盖操作可能带来的交叉污染，进一步降低了假阳性结果的发生概率，提高了检测的准确性。而且，检测结果既可以通过荧光曲线判断，也可以通过在紫外灯下观察颜色变化来直观判断，无需依赖复杂的仪器设备，使得该技术在资源有限的地区和现场检测中具有广阔的应用前景。

图3. LAMP - CRISPR/Cas12a系统的抗干扰试验。A - a：两步法：紫外灯下的颜色变化；A - b：两步法：荧光曲线；B - a：一管法检测：紫外灯下的颜色变化；A - b：一管法检测：荧光曲线；1至7：浓度为N×10⁶ CFU/mL至N×10⁰ CFU/mL。

展望

LAMP-CRISPR/Cas12a检测技术的出现，为大肠杆菌O157:H7的快速检测提供了一种全新的解决方案。它不仅克服了传统检测方法的诸多不足，还以其高灵敏度、高特异性、操作简便和快速的特点，展现出巨大的应用潜力。未来，随着该技术的进一步优化和完善，相信它将在食品安全检测领域发挥更加重要的作用，为保障公众健康和食品安全做出更大贡献。

参考文献：

Wang Z, Chen H, Hu A, et al. Establishment of LAMP-CRISPR/Cas12a for rapid detection of Escherichia coli O157: H7 and one-pot detection[J]. Food Microbiology, 2024, 124: 104622.