双纳米酶“接力赛”：解锁氨基糖苷类抗生素的特异性比色检测新路径

研究背景

氨基糖苷类抗生素（AGs）是广谱抗生素，因其高效性、经济性和广谱性被广泛应用于临床和畜牧业。然而，AGs的使用存在诸多问题，包括耳毒性、肾毒性、环境残留以及细菌耐药性增加等。因此，开发有效的AGs检测方法对于保障公共健康至关重要。目前的检测方法包括微生物法、免疫分析法、高效液相色谱法、电化学技术、荧光法和比色法等。其中，比色传感器因操作简便、成本低、设备要求少、信号输出直接且检测速度快等优点，特别适合高通量分析和实时监测。传统比色检测方法多为单一目标检测，而能够同时检测同一类抗生素的方法可以减少样本用量并提高检测效率。

研究原理

多酶级联反应通过两个或多个酶的联合作用将底物进行两步或多步转化，具有高选择性、催化效率和信号放大特性。本研究设计了一种能够特异性检测AGs的双纳米酶级联复合材料（Au@mPDA/PAA-Cu₂MI，AmPC）。AGs具有独特的氨基糖分子结构，受金纳米颗粒在葡萄糖氧化中的催化特性启发，本研究在介孔聚多巴胺通道中原位合成了金纳米颗粒（Au@mPDA），以启动级联反应的第一步。在这一步中，Au NPs催化AGs的氧化，并在O₂存在下产生H₂O₂。随后，通过聚丙烯酸（PAA）与mPDA和金属离子的相互作用，将PAA-Cu₂MI与Au@mPDA结合。PAA-Cu₂MI复合材料具有类似过氧化物酶（POD-like）活性，能够以H₂O₂为底物氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB），产生蓝色信号用于比色检测初始目标。这种级联反应能够有效响应多种AGs，产生针对每种检测到的AGs的独特比色信号（图1）。

图1（a）AmPC的合成路径；（b）通过级联催化检测庆大霉素（GMC）。

研究内容及结果

（1）AmPC复合材料的制备及表征：透射电子显微镜（TEM）结果表明AmPC呈现直径约为350 nm的球形结构，能量色散X射线光谱（EDS）证明Au、Cu、C、N和O元素在复合材料中均匀分布，表明成功制备了复合材料。AmPC的粉末X射线衍射（PXRD）图谱显示了Au NPs的（111）晶面特征峰，以及PAA-Cu₂MI在约14°处的特征峰和Au@mPDA/PAA的无定形特征，进一步证实了复合材料的成功制备。AmPC的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）包含了各组分材料的特征峰，且外层PAA-Cu2MI的峰强度最高，进一步确认了复合材料的成功制备，其X射线光电子能谱（XPS）分析材料的元素组成和键合状态结果与FT-IR结果一致。

（2）验证类酶催化活性（图2）：Au@mPDA/PAA表现出aGOx-like活性，可以催化GMC氧化生成H₂O₂，但缺乏POD-like和OXD-like活性。PAA-Cu₂MI表现出优异的POD-like活性，能够高效利用H₂O₂催化TMB显色反应，但缺乏aGOx-like活性。两者的最佳反应条件相似（最佳pH和温度条件），为化系统提供了便利。此外，催化动力学研究表明PAA-Cu2MI对TMB具有高亲和能力，极大地提高了催化效率，缩短了级联反应所的时间，为AmPC复合材料用于氨基糖苷类抗生素的检测提供了理论基础。

图2 验证Au@mPDA/PAA（a）和PAA-Cu₂MI（b）的酶活性（红色：类aGOx活性；蓝色：类POD活性；绿色：类OXD活性）；初始反应速率与不同浓度的TMB（c）和H₂O₂（d）的关系；针对TMB（e）和H₂O₂（f）的POD活性的Lineweaver-Burk作图。

（3）GMC的级联反应及检测（图3）：复合材料AmPC表现出aGOx和POD的双重活性。在串联反应中，AmPC的催化性能优于单独添加两种纳米酶的体系。性能提升归因于纳米限制域邻近效应和底物通道限制效应。两种纳米酶在mPDA介孔通道中紧密接触，减少了中间体扩散，提高了H₂O₂的利用效率。在最优检测条件下，AmPC用于GMC的比色检测，检测范围为0.1−10 μg/mL，检测限为91 ng/mL。该方法能够特异性识别AGs，无需核酸适配体筛选或昂贵抗体。

图3（a）串联反应路径示意图；（b）AmPC的酶活性验证；（c）GMC检测的可行性（1：AmPC +GMC；2：AmPC+TMB；3：AmPC+GMC+TMB；4：Au@mPDA/PAA+PAA-Cu₂MI +GMC+TMB）；（d）GMC对应的线性校准曲线。

（4）实际应用（图4）：研究表明，构建的级联反应体系不仅能检测葡萄糖（GMC），还能检测其他氨基糖苷类抗生素（如阿米卡星、链霉素、卡那霉素和妥布霉素）。由于分子结构的差异，每种AG在反应后会产生不同的颜色变化和紫外-可见吸收光谱。进一步的研究表明，制备的AmPC材料具有较好的可回收性且基于AmPC的方法具有较好的抗干扰能力。

图4（a）多种氨基糖苷类抗生素（AGs）的检测；（a）用于氨基糖苷类抗生素（AGs）分类的主成分分析（PCA）；（c）不同抗生素的响应；（d）串联反应对氨基糖苷类抗生素（AGs）检测的选择性。

（5）反应机制探索（图5）：级联催化串联反应的具体路径为GMC首先被吸附到Au@mPDA/PAA的孔隙中，Au从GMC提取电子并将其转移到溶解氧中，催化生成H₂O₂。随后，PAA-Cu2MI催化H₂O₂转化为单线态氧，并促进已吸附的TMB与H₂O₂之间的电荷转移，导致两者相互作用，形成特征蓝色的氧化TMB。此外，通过在真实水样（自来水和黄河水）和商业药品样本（硫酸庆大霉素、硝酸铋胶囊和硫酸庆大霉素注射液）中进行标准添加实验，证明了方法具有良好的稳定性和重现性。

图5（a）将ABTS⁺作为终端电子受体以验证电子转移；（b）Au@mPDA/PAA在N₂和O₂饱和的0.1 M NaOH溶液中（有无GMC）的循环伏安图；（c）活性氧自由基清除实验；（d）用于证明电子转移的细胞色素c（Cyt c）实验；（e）串联反应的催化机制。

研究结论

本研究通过通过将具有aGOx（葡萄糖氧化酶类似）活性的金纳米颗粒（Au NPs）和具有POD（过氧化物酶类似）活性的Cu-2MI整合到mPDA和PAA中，制备了AmPC复合材料。AmPC系统促进了具有协同两步反应条件的串联催化过程，使得可以使用AGs（氨基糖苷类抗生素）作为初始底物、H₂O₂作为中间产物，进行特异性的比色检测。以葡萄糖（GMC）为例，该系统展示了0.1-10 μg/mL的线性检测范围，检测限（LOD）低至91 ng/mL。该过程能够有效识别多种AGs，包括链霉素（SMC）、葡萄糖（GMC）、卡那霉素（KMC）、阿米卡星（AMC）和妥布霉素（TMC），而对其他抗生素无响应。这种特异性突出了纳米酶在串联反应框架内的选择性能力。总体而言，制备的AmPC复合材料通过模拟多酶级联反应，实现了对多种AGs的高效、特异性检测，同时解决了纳米酶选择性不足和级联反应兼容性差的问题。方法显著提升了纳米酶的应用范围和检测效率，为抗生素的快速检测提供了新的思路。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06854