双靶向探针编码枫叶型荧光侧流免疫分析：一种双向友好的多重生物标志物检测平台

研究背景

生物标志物用于精准医疗可改善人类健康并降低医疗成本，尤其在疾病诊断方面。单一生物标志物常因特异性和灵敏度不足导致高假阳性率，因此需要同时检测多种生物标志物。侧流免疫分析（LFIA）作为即时检测（POCT）设备，具有快速、简便的优点，已广泛用于慢性病早期筛查。然而，LFIA在检测生物样本中低丰度生物标志物时面临挑战，需提高检测策略和灵敏度。多重LFIA的检测策略均需针对不同靶标制备相应探针，增加了制造商的复杂性和成本。

研究原理

本研究开发了一种双向有利的侧流免疫分析平台（BDF-LFIA），通过使用双靶向探针和枫叶型颜色读出，实现了多种生物标志物的同时检测，为制造商和用户带来便利。该平台采用商业红色发射的时间分辨荧光纳米颗粒（TRFNs）和合成的超亮绿色发射的金纳米簇（AuNCs）作为荧光发射体，以癌症生物标志物甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）为模型目标，构建了双靶向探针。通过一步法合成的双靶向探针简化了制备过程，且不影响抗原识别能力。通过引入精氨酸分子（Arg）增强AuNCs的发光性能和光稳定性。BDF-LFIA在AFP和CEA浓度增加时，T线颜色从绿色变为黄色再到红色，类似枫叶的自然变化，便于裸眼识别，并可通过比色卡进行半定量分析（图1）。

图1 基于两种相反荧光发射体（TRFNs和Arg/ATT-AuNCs）的双向有利侧流免疫分析（BDF-LFIA）平台示意图：双靶向探针和Arg/ATT-AuNCs的制备以及BDF-LFIA用于癌症生物标志物检测的原理。

研究内容及结果

（1）双靶向探针的制备与性能验证（图2）：通过抗体的氨基与TRFNs表面的羧基之间的共价反应，将抗AFP或抗CEA抗体（或两者混合）偶联到TRFNs表面，制备单靶向或双靶向探针。动态光散射（DLS）结果表明抗体修饰后的Ab-TRFNs水动力尺寸大于裸TRFNs，且zeta电位略有增加。将单靶向或双靶向探针加入涂有AFP或CEA抗原的ELISA板中进行ELISA实验，在450 nm处观察到吸光度值，表明探针成功识别抗原。双靶向探针的OD₄₅₀值显著高于单靶向探针，表明双靶向探针在结合抗原后仍保留更多抗体，从而结合更多HRP标记的IgG。这一结果也间接证实了两种抗体同时存在于同一纳米颗粒上，具备良好的双抗原识别能力，可同时检测AFP和CEA。进一步制备了荧光侧流免疫分析（F-LFIA）试纸条，测试其同时检测多种目标的能力。结果表明即使在高浓度AFP存在的情况下，双靶向探针对CEA的检测灵敏度仍不受影响，与单独检测CEA时的性能相似。与传统方法比较而言，双靶向探针在保持检测灵敏度的同时，简化了制备过程，降低了成本，为多重检测提供了高效、经济的解决方案。

图2 双靶向探针的制备及性能验证。（a）Ab-TRFNs制备过程示意图；（b）以AFP为例的ELISA实验示意图；（c）ELISA实验的定量分析（A-TRFNs、C-TRFNs和A-C-TRFNs分别代表抗AFP-TRFNs、抗CEA-TRFNs和抗AFP-CEA-TRFNs）；（d）FLFIA对不同浓度AFP和CEA的荧光图像，分别使用（i）多探针和（ii）双靶向探针；使用双靶向探针和多探针对（e）AFP和（f）CEA进行定量的校准曲线。

（2）AuNCs的合成与表征：通过主-客体相互作用，合成精氨酸（Arg）修饰的AuNCs（Arg/ATT-AuNCs）。透射电子显微镜（TEM）等多种表征技术表明Arg/ATT-AuNCs保持ATT-AuNCs的球形结构，其水动力尺寸略有增大，zeta电位从-54.3 mV增至-22.8 mV。Arg修饰后，Arg/ATT-AuNCs的最大发射波长未受影响，其发光强度增强超过10倍，量子产率为29%，平均寿命为113.48 ns，显著长于Arg修饰前（29.85 ns）。Arg/ATT-AuNCs在宽pH范围内具有稳定的荧光强度，连续光照下光稳定性良好，且在储存7周后荧光强度基本不变。这些特性使其在基于颜色识别的LFIA中具有巨大潜力，为开发新型LFIA平台提供了有力支持。

（3）基于TRFNs和Arg/ATT-AuNCs的色相转化策略的验证（图3）：颜色变化的灵敏度是基于颜色识别策略的关键参数，高度依赖于两种荧光发射体的颜色纯度和初始荧光强度比。通过模拟和溶液中的实际验证研究了将Arg/ATT-AuNCs（绿色发射体）和TRFNs（红色发射体）应用于颜色转换策略的可行性。结果表明TRFNs和Arg/ATT-AuNCs在溶液中和NC膜上均显示出清晰的颜色转换，具有高灵敏度和区分度，为基于颜色识别的LFIA提供了有效的解决方案。

图3 TRFNs和Arg/ATT-AuNCs的颜色纯度验证及枫叶型色调转换。（a）实验验证的示意图；（b）混合物的荧光光谱以及（c）在CIE 1931色度图中对应的坐标，这些混合物的红绿比从10:0到0:10；（d）从CIE色度坐标获得的模拟色块以及在96孔板中紫外光下实际溶液颜色的照片；（e）模拟和实际色块中相邻两种颜色之间的ΔE值；（f）实际色块的R、G和R/G值。

（4）实际应用（图4）：基于两种高纯度荧光发射体（TRFNs和Arg/ATT-AuNCs）开发了BDF-LFIA平台，用于同时检测AFP和CEA。BDF-LFIA包含两条检测线（T线）和一条对照线（C线）：T1线和T2线分别为抗AFP抗体和抗CEA抗体与Arg/ATT-AuNCs@BSA结合。在最优检测条件下，该检测平台能在0-500 ng/mL浓度范围内检测AFP和CEA，T线随目标浓度增加显示出从绿色到黄色再到红色的颜色变化。其视觉检测限（vLOD）为2 ng/mL，低于传统荧光LFIA的10 ng/mL（AFP）和5 ng/mL（CEA）。BDF-LFIA可通过参考色卡实现裸眼半定量分析，使用Color Picker应用进行定量分析，随着浓度增加，G值降低，R值增加，T线的R/G值与AFP浓度（5-100 ng/mL）和CEA浓度对数（2-500 ng/mL）呈良好的线性关系。此外，研究证明方法具有良好的选择性和重现性，以及可接受的准确性和实用性。

图4 BDF-LFIA多重生物标志物检测的分析性能。（a）BDF-LFIA对不同浓度AFP和CEA的荧光图像；（b）T线对不同浓度AFP的R值和G值；（c）T线对不同浓度CEA的R值和G值；（d）T线的R/G值与AFP浓度的关系图，插图为目标检测的线性曲线；（e）T线的R/G值与CEA浓度的关系图，插图为目标检测的线性曲线；（f）特异性（1：AFP+CEA，2：AFP/CEA，3：CEA/AFP，4：HSA，5：BSA，6：DCP，7：PG I，8：PG II，9：NSE，10：空白）；（g）重复性；（h）BDF-LFIA的回收率和RSD结果。

（5）BDF-LFIA在临床血清样本中的应用：对54份真实血清样本进行分析，包括10份阴性样本、22份CEA阳性样本和22份AFP阳性样本。结果表明，BDF-LFIA能够有效区分阳性样本和阴性样本。受试者工作特征曲线（ROC）分析表明BDF-LFIA展现出优异的诊断准确性，其定量检测AFP和CEA的结果与临床方法具有高度相关性，Pearson相关系数分别为0.9916和0.9413。以上结果证明了BDF-LFIA在复杂生物样本中准确的诊断能力。

研究结论

开发了一种基于两种发射体的双向有利侧流免疫分析（BDF-LFIA），用于多种生物标志物的灵敏检测。使用商业时间分辨荧光纳米颗粒（TRFNs）包被抗AFP和抗CEA抗体，形成具有窄发射峰和双重靶标识别能力的探针。将两种抗体整合到同一纳米颗粒中，不仅降低了制造商制备探针的成本，还确保了检测的特异性和灵敏度。通过改变抗体类型，这种探针可以检测各种生物标志物，有望成为一种通用型探针。此外，通过在ATT-AuNCs的表面层中加入精氨酸（Arg），获得了具有良好水溶性和稳定性的超亮绿色发射的Arg/ATT-AuNCs。将这两种发射体整合到侧流免疫分析平台中，在检测线上实现了浓度依赖的枫叶型颜色变化。相较于传统的LFIA，基于颜色识别的BDF-LFIA更加灵敏且用户友好。BDF-LFIA有望广泛应用于疾病诊断，尤其是在多种生物标志物的联合检测方面。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06414