双读荧光“开启”侧流免疫分析法：高灵敏检测吡虫啉的突破性技术

吡虫啉（Imidacloprid, IMI）作为新烟碱类杀虫剂的代表，自1991年问世以来，因其高效广谱的特性，成为全球农业害虫防治的“明星产品”。然而，其高毒性对蜜蜂、家蚕等传粉昆虫的威胁引发了严重的生态担忧——全球三分之一的农作物依赖昆虫授粉，蜜蜂数量下降将直接威胁粮食安全和生物多样性。欧盟已于2018年禁止IMI的户外使用，中国等国也制定了严格的残留限量标准（如茶叶中0.5 mg/kg）。传统检测方法如高效液相色谱（HPLC）和质谱联用技术虽灵敏准确，但依赖昂贵仪器和专业人员，难以满足现场快速检测需求。侧流免疫分析法（LFIA）凭借操作简便、成本低廉的优势成为理想替代方案，但传统金纳米颗粒（AuNPs）为基础的比色法灵敏度不足，且“信号关闭”模式（信号强度与目标物浓度成反比）限制了检测性能。中国计量大学王建平团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表的最新研究中，提出了一种基于内滤效应（IFE）的双读荧光“开启”侧流免疫分析法（图1），通过巧妙设计荧光供体（BSAAuNCs）与猝灭剂（HAuNPs）的协同作用，实现了IMI的超灵敏检测。接下来我们对这项研究进行解读。

图1 检测原理示意图

创新亮点：双读荧光“开启”模式的突破

1. “双读模式”：同时支持荧光（LOD 7.8 pg/mL）和比色（LOD 47.8 pg/mL）双信号输出，灵敏度较传统AuNPsLFIA提升6倍。

2. “荧光开启”机制：利用IFE原理，目标物存在时触发荧光信号增强，突破传统“信号关闭”模式的灵敏度瓶颈。

3. 环境友好与经济性：BSAAuNCs的绿色合成工艺和HAuNPs的可调控光谱特性，降低了制备成本。

技术原理

图2 HAuNPs吸收光谱与BSA-AuNCs之间的IFE

- 关键组分设计

BSAAuNCs：牛血清白蛋白（BSA）包裹的金纳米簇，发射强红色荧光（640 nm），量子产率约6.2%，且合成工艺简单（一锅法）。 

HAuNPs：覆盆子状空金纳米颗粒，可通过调节氯金酸和硼氢化钠的投料量，优化吸收光谱（峰值640 nm），实现与BSAAuNCs的最大光谱重叠。 

- 检测机制 

1. 无IMI时：HAuNPs标记的抗体与T线固定抗原结合，IFE效应导致BSAAuNCs荧光猝灭，T线显示蓝色（HAuNPs聚集）。 

2. 有IMI时：IMI与T线抗原竞争结合HAuNPs抗体，HAuNPs无法到达T线，荧光信号恢复，且IMI浓度越高，荧光强度越强（图3AB）。

图3 用于检测IMI的双读数荧光“开启”LFIA检测条的分析评估

实验验证：从表征到实际应用 

- 材料表征 

HAuNPs：TEM显示粒径约55 nm，表面粗糙的覆盆子结构（图4A）；STEMEDS证实Au壳层和残留Co核（图4B）。 

BSAAuNCs：HRTEM显示清晰的晶格条纹（0.23 nm，对应Au(111)晶面），粒径24 nm（图4 DE）。 

图4 材料表征

- IFE效率验证 

光谱重叠：HAuNPs的吸收光谱与BSAAuNCs的发射光谱高度重合（图2A），确保高效猝灭。 

静电排斥：BSAAuNCs和HAuNPs均带负电（Zeta电位20.52 mV vs. 10.01 mV），排除了FRET机制，证实IFE主导猝灭（图2 FG）。

- 检测性能

灵敏度：荧光模式LOD低至7.8 pg/mL，线性范围0.022 ng/mL（图3E）；比色模式LOD 47.8 pg/mL（图3D）。 

特异性：对乙磺隆、多菌灵等11种干扰物质无交叉反应（图3FG）。 

稳定性：试纸条室温储存1个月后，T/C信号值仅下降1.9%，满足实际应用需求。 

实际应用：茶叶样本中的IMI检测 

研究团队以菊花茶和绿茶为实际样本，验证了方法的可靠性：加标回收率：82.40%-113.80%，RSD <11.88%。与LCMS/MS对比：50份样本中6份阳性结果一致，相关性R²=0.9807。

该技术的成功不仅为农药残留检测提供了新工具，更启发了多模态LFIA的设计思路：1. 人工智能整合：结合机器学习算法，实现试纸条图像的自动分析与结果判读。2. 多目标物联检：通过设计多色荧光探针，同步检测多种农药或毒素。3. 环境与医疗应用：拓展至水体污染监测或疾病标志物快速筛查。

这项研究通过巧妙的纳米材料设计与IFE机制创新，将LFIA的灵敏度推向了新的高度。双读模式不仅满足了实验室精准分析的需求，更适用于田间地头的即时检测，为保障食品安全和生态平衡提供了有力工具。未来，随着智能算法的加持，这项技术有望在更多领域绽放光彩。 

DOI： 10.1016/j.bios.2025.117379