无标记检测新突破，DNA适配体助力神经退行性疾病诊断

肾上腺素（Epinephrine, EP）和去甲肾上腺素（Norepinephrine, NE）是人体内关键的儿茶酚胺类神经递质，参与情绪调节、记忆形成和应激反应等生理过程。它们的异常水平与阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等多种神经退行性疾病密切相关。目前，临床主要通过尿液检测EP和NE来诊断高儿茶酚胺血症，但传统方法（如液相色谱质谱联用）存在成本高、耗时长等问题。因此，开发快速、低成本且高灵敏的检测技术成为研究热点。近期，滑铁卢大学的刘珏文教授以通讯作者的身份在《Biosensors and Bioelectronics》发表了名为《Capture-SELEX of DNA aptamers for label-free detection of epinephrine and norepinephrine in urine》的研究论文，介绍了研究团队使用DNA适配体对EP和NE检测的新方法，接下来我们将对此研究进行解读。

首先，我们需要知道什么是SELEX与DNA适配体。SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）是一种体外筛选技术，通过多轮筛选从随机寡核苷酸库中富集出能够特异性结合靶标分子的序列，最终获得高亲和力的适配体（Aptamer）。适配体被称为“化学抗体”，具有合成简便、稳定性高、无免疫原性等优势，广泛应用于生物传感领域。本研究采用Capture-SELEX（文库固定化SELEX）技术（图1），通过将DNA文库固定在链霉亲和素琼脂糖微珠上，结合靶标分子后释放特异性序列，经PCR扩增后进入下一轮筛选。经过15轮筛选（EP）和14轮筛选（NE），团队成功获得候选适配体。

图1：Capture-SELEX流程示意图

通过高通量测序，团队从第15轮筛选中获得8个高频序列（图2A），其中70%属于同一家族。以EP1适配体为例，其二级结构包含两个保守环区（红色和蓝色标记）及中间的非保守发夹结构（图2B）。这种结构可能通过环区与靶标分子的功能基团（如儿茶酚环和侧链羟基）特异性结合。

图2：EP适配体序列与结构

之后，对其亲和力与选择性进行验证。硫黄素T（ThT）荧光法和等温滴定量热法（ITC）被用于评估EP1的亲和力：

- ThT实验显示，EP1对EP的亲和力（Kd = 12.2 μM）显著高于NE（Kd = 36.6 μM）（图3A）。 

- ITC结果进一步验证了EP与EP1的结合为放热反应，Kd值为9.4 μM，结合比为1:1（图3B）。

此外，EP1对多巴胺（DA）、酪胺（Tyr）及其他生物分子（如抗坏血酸、尿素）几乎无响应，表现出优异的选择性（图3C）。 

图3：EP1适配体的结合特性|(A) ThT荧光滴定曲线；(B) ITC结合热力学分析；(C) 选择性测试

尽管团队以NE为靶标进行了14轮筛选，并成功富集到NE1适配体序列（图4A），但后续实验（ThT、ITC、链置换反应）均未检测到结合信号。作者推测，NE侧链的游离伯氨基可能与文库设计或筛选条件不兼容，导致假阳性富集。这一结果为未来NE适配体研究提供了重要参考。

图4：NE适配体序列与结构|(A) NE筛选后的高频序列；(B) NE1适配体二级结构预测

之后，团队进一步比较了EP1与已报道的多巴胺适配体DA1（Kd = 1.4 μM）的结合特性。结果显示： 

- DA1主要识别儿茶酚环，对NE（Kd = 19.4 μM）和EP（Kd = 59.2 μM）的亲和力较弱。 

- EP1的独特优势在于其结合不仅依赖儿茶酚环，还与侧链的羟基和甲基相互作用，从而实现对EP/NE的特异性识别（图5）。 

图5 EP1与DA1适配体的潜在结合机制对比

基于EP1适配体，团队开发了一种ThT介导的荧光传感器，用于尿液中EP/NE的检测。通过向尿液样本中加标目标分子，荧光强度随浓度升高而显著降低，检测限分别达到0.41 μM（EP）和0.83 μM（NE）。该方法无需复杂标记或昂贵设备，为临床快速筛查提供了新思路。 

尽管EP1适配体在检测中表现出高灵敏度和选择性，但其对多种儿茶酚胺的交叉反应可能限制实际应用。作者建议通过构建传感器阵列（整合不同适配体）解决这一问题。此外，适配体长度（约30 nt）和未修饰DNA的设计使其成本显著低于传统抗体，适合大规模推广。本研究不仅为神经递质检测提供了新型工具，还揭示了适配体设计中靶标分子侧链功能基团的重要性。未来，结合纳米材料或微流控技术，EP1适配体有望在POCT（即时检测）和个性化医疗中发挥更大作用。 

 DOI: 10.1016/j.bios.2025.117392