无监督学习辅助声学驱动纳米透镜全息技术：实现活细菌超灵敏无扩增检测的创新方法

1. 引言

细菌感染是公共卫生安全的重要威胁，特别是在资源有限的地区，需要快速、灵敏、高性价比的检测平台。现有的实时定量聚合酶链反应（qPCR）虽然灵敏度高，但依赖于DNA扩增和昂贵设备。新兴的核酸检测技术虽然有优势，但也面临类似挑战。无透镜全息成像技术可以提供大视场和高吞吐量，但其灵敏度受限于光衍射和传感器性能。为了提高灵敏度，创新策略如虚拟细分传感器像素和纳米透镜被采用。近年来，深度学习技术在全息成像中得到应用，但传统的监督学习需要大量标注数据。因此，开发不依赖大量标注数据的新型深度学习方法（如无监督学习）对于实现超灵敏和无扩增的细菌检测至关重要。

本研究报道了一种无监督学习（UL）辅助的声波驱动纳米透镜全息生物传感平台（UL-snh），用于超灵敏且无放大的活菌检测。该平台利用噬菌体特异性捕获活菌并诱导其释放DNA，随后激活CRISPR-Cas12a系统进行转切割，产生生物素修饰的单链DNA（ssDNA）。ssDNA通过生物正交反应连接信号探针与磁性纳米粒子，增强检测灵敏度。多种靶向CRISPR RNA与Cas12a复合，提高切割效率。通过逐步添加试剂，反应改变上清液中探针数量，与目标菌浓度相关联。利用SNH显微镜捕获全息图，并通过纳米透镜效应提升信噪比，实现超宽视场下的高灵敏成像。UL辅助图像处理算法无需大量标注数据即可完成小批量训练，实现精确目标检测。

方案1. UL-SNH细菌检测生物传感平台示意图。a) UL-SNH检测细菌的生化反应机制，包括CRISPR-Cas12a触发生物传感和人工智能（AI）信号转导。b) saw - idt驱动的纳米透镜全息显微镜。c) SNH显微镜光学系统设计。高信噪比全息成像器件主要由CMOS传感器、SAW-IDT芯片、微调控制器、盖片、连接放大的函数发生器和调制LED部分相干光源组成。

2. 结果与讨论

ul辅助图像处理和灵敏度评估

UL辅助图像处理方法采用几何深度学习，无需标记即可实现目标检测。通过平移、反射、旋转等变换，UL-CNN预测检测目标的位置。该方法在全息图中检测单个PS微球时，通过几何变换识别目标中心，准确定位粒子。UL-CNN生成两个特征张量，表示像素到目标的方向和权重，计算出变换后微球位置的预测值。这种方法在低信噪比条件下优于传统方法，如ImageJ和CV方法，准确率超过98%。UL-CNN的轻量级架构减少了训练时间和GPU需求，使其适用于高效处理大量全息图。

图1. 辅助图像处理方法检测SNH显微镜捕获的不同PS微球全息图的评价。

UL-SNH生物传感平台的可行性与表征

传统的CRISPR-Cas12a检测方法通常需要DNA扩增以提高效率，但这增加了成本和污染风险。为了评估无需扩增的方法，研究人员使用多个crRNA组合激活Cas12a，发现这种组合可以显著增强反式切割活性。实验结果显示，多crRNA组合激活的Cas12a对探针的切割效率更高。同时，通过显色反应、动态光散射和zeta电位分析，验证了PS微球与磁性纳米粒子（MNPs）的成功耦合。噬菌体捕获活菌的特异性也通过SEM表征得到证实，证明了UL-SNH生物传感平台的可行性。

图2. UL-SNH生物传感平台的可行性及表征。

鼠伤寒沙门氏菌UL-SNH生物传感检测平台

UL-SNH生物传感平台用于检测鼠伤寒沙门氏菌，通过优化噬菌体介导的DNA提取、纳米透镜形成和CRISPR-Cas12a系统。该平台在室温下无需扩增即可检测活菌，特异性依赖于LPST10噬菌体和CRISPR-Cas12a系统的双重保障。实验结果表明，UL-SNH对鼠伤寒沙门氏菌的捕获效率高达85%，检测特异性优异。与qPCR方法相比，UL-SNH在检测时间（约1小时）、成本（约500美元）和灵敏度（38 CFU mL⁻¹）方面具有优势。UL-SNH在猪肉样品中的加标回收率为94.9 ~ 109.3%，变异系数小于13.0%，证明其准确性和重复性良好。该平台集成了多种技术，提供了一种成本效益高、用户友好的生物传感解决方案。

图3. UL-SNH生物传感平台鼠伤寒沙门氏菌检测结果。

真实样本分析

UL-SNH生物传感平台用于检测鼠伤寒沙门氏菌，采用人工污染的食品样品（N=45）和临床样品（N=15）进行评估。结果显示，UL-SNH在检测低浓度样品时优于qPCR，成功识别出活菌且无假阳性。UL-SNH和qPCR对阳性样品的检测结果一致性较好（R²=0.97）。尽管UL-SNH表现出超灵敏的检测能力，但仍需要改进样品预处理和处理步骤的自动化，以适应现场检测。此外，复杂基质中的干扰因素和PS信号探针的聚集状态需要进一步研究。未来工作将结合自动化设备和多路检测能力，以实现即时检测。

图4. 鼠伤寒沙门氏菌UL-SNH生物传感检测平台实样分析。

3. 总结

本研究设计了一种基于无监督学习辅助和SAW-IDT驱动的纳米透镜全息生物传感平台，专注于超灵敏和无放大的活菌检测。该平台通过纳米透镜全息显微镜突破了传统低信噪比的限制，实现了小尺寸聚苯乙烯（PS）微球信号探头的超灵敏全息成像，具有超宽视场和高灵敏度。无监督学习辅助的目标检测算法能够准确识别PS微球，无需人工标记数据集和高配置计算机，仅需快速训练即可进行信号转导。这种策略将无监督学习和超灵敏全息成像技术整合到一个生物传感平台中，与之前的工作和传统的qPCR方法相比，在时间、成本和准确性方面具有显著优势。

论文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202406912