实时洞察：铜绿假单胞菌胞外囊泡研究取得关键进展

EV 作为细胞间通信、疾病生物标志物和疫苗开发的关键因素，在生物学领域备受关注。然而，其群体的高度异质性使得传统分析方法难以准确揭示其特性。现有单囊泡检测技术，如拉曼镊子光谱、原子力显微镜等，存在通量低、样本制备繁琐的问题；而一些高通量方法又不适用于复杂样本的原位监测。

此次研究中，ZMW 发挥了关键作用。其纳米尺寸的孔径限制入射辐射形成消逝场，将光学体积限制在 zeptoliter 级，不仅能实现生理浓度下的单实体研究，还可有效减少背景荧光干扰。同时，ZMW 的纳米圆柱几何结构基于尺寸排除了细菌细胞，避免了繁琐的样本分离步骤。研究人员将 ZMW 制成 21×21 的阵列，可并行观察 441 个单个观察体积。利用亲脂性荧光团标记 EV 膜，通过宽场荧光显微镜实时监测单个 EV 进入和离开纳米孔的过程。

图 1：呈现零模波导（ZMW）的结构、检测原理及 EVs 荧光成像与信号变化。

图 2：展示样品制备方法对铜绿假单胞菌 EVs 检测事件频率和峰宽的影响。

研究人员对不同制备方法（细菌培养物、培养上清液和培养滤液）得到的铜绿假单胞菌 EV 进行检测，发现样本制备方法显著影响 EV 在纳米孔中的占据特征。过滤后的样本检测事件频率增加，驻留时间缩短，这与样本制备过程中溶液粘度变化及 EV 尺寸改变有关。研究还对比了野生型和 ΔpqsA 突变型铜绿假单胞菌产生的 EV，证实了 EV 产生机制与尺寸、事件频率和驻留时间的关系。此外，该技术还能检测革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的 EV，表明其具有广泛的适用性。

图 3：对比野生型和 ΔpqsA 突变型铜绿假单胞菌产生的 EVs 尺寸、事件频率和驻留时间差异。

图 4：反映环丙沙星对铜绿假单胞菌 EV 形成数量的实时影响。

在实时监测方面，研究人员通过添加抗生素环丙沙星，观察到铜绿假单胞菌培养物中 EV 数量在 6 分钟时显著增加，证明 ZMW 纳米孔阵列能够实时监测外部因素引起的 EV 群体功能变化。

尽管 ZMW 技术优势明显，但也存在一定局限性，如对较大 EV 的检测能力有限。不过，该技术无需复杂样本制备、可高通量检测单囊泡的特性，为现有 EV 监测工具增添了新选择。未来，研究人员计划进一步探索其在更多抗生素研究中的应用，以深入了解 EV 与抗生素之间的关系。

参考文献：

[1]  Metro J, Weaver A A, Reitemeier J, et al. Monitoring Populations of Single Extracellular Vesicles from Pseudomonas aeruginosa Using Large Parallel Arrays of Zero-Mode Waveguides[J]. Precision Chemistry, 2025.