机器学习辅助多重荧光标记miRNA成像解码技术用于霉菌毒素联合毒性评估

霉菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，广泛污染粮食及饲料，对人类和动物健康构成严重威胁。其中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN） 是两种常见的共污染毒素。DON属于单端孢霉烯族毒素，主要污染小麦、玉米等谷物，可抑制蛋白质合成，引发细胞凋亡。ZEN具有雌激素样作用，长期摄入会导致生殖系统损伤。全球范围内，DON和ZEN的共同污染现象普遍。荷兰75%的牧草和玉米青贮样本中同时检出这两种毒素。然而，传统毒性评估方法（如RT-qPCR、Western Blot）需裂解细胞，导致数据丢失且无法实时监测。因此，开发非破坏性、多靶点的检测技术至关重要。

研究者提出了一种基于Exonuclease III（EXO III）信号放大的荧光分子信标（Molecular Beacon, MB）探针，结合机器学习算法，实现了细胞内三种miRNA（miR-21、miR-221、miR-27a）的同时成像与毒性评估（图1）。

图1 实验设计全流程

1. 荧光分子信标的设计与信号放大

- MB探针结构：由识别区（靶向miRNA序列）和荧光信号区（5'端荧光基团，3'端淬灭基团）组成。未结合靶标时，MB呈发夹结构，荧光被淬灭（“关闭”状态）。 

- EXO III的作用：当miRNA与MB结合形成DNA/RNA双链后，EXO III特异性切割双链的3'平末端，释放miRNA和荧光基团，实现信号放大（图2D-F）。这一过程可循环进行，显著提高检测灵敏度（检测限低至0.18-0.22 pM）。

图2 MBs检测相应miRNAs的特异性

2. 细胞内递送与成像

- 脂质体介导的探针递送：通过脂质体（Lipo3000）将MB和EXO III高效递送至HepG2细胞，避免探针降解（图3 A）。 

- 三通道荧光成像：不同miRNA对应不同荧光通道（miR-21→绿色，miR-221→红色，miR-27a→蓝色），实现实时、非破坏性的多靶点监测（图 1B）。

图3 脂质体递送与细胞内荧光成像

3. 机器学习解码荧光信号

- 特征提取：从荧光图像中提取RGB值作为miRNA表达的“视觉指纹”（图3D-E）。

- 模型构建：

a 线性判别分析（LDA）：用于分类不同浓度DON/ZEN诱导的miRNA表达模式（图3F-G）。

b 主成分分析（PCA）：降维后建立线性回归模型，量化毒素浓度与荧光强度的关系（图4C, 4F）。

- 最高单一效应（HSA）模型：评估DON与ZEN的联合毒性（协同或拮抗），公式为E_AB = max(E_A, E_B)。

图4 基于PCA方法的分析

研究者开发的这种方法，也表现出了良好的检测性能，主要体现在高灵敏度和高准确性预测两个方面：

1. 高灵敏的miRNA检测

- 体外检测性能：EXO III信号放大使检测灵敏度提升200-300倍，miR-21、miR-221、miR-27a的检测限分别为0.18 pM、0.22 pM和0.21 pM。 

- 细胞内成像：EXO III显著增强荧光信号（图3B），且探针递送不影响细胞活力。

2. 机器学习模型的优越性

- LDA分类准确率达100%，PCA降维后主成分与毒素浓度高度相关（图4B, 4E）。

- HSA模型揭示剂量依赖性毒性：a 低剂量ZEN（DON:ZEN=100:1）：拮抗作用（ZEN抑制DON毒性）。b 高剂量ZEN（DON:ZEN=1:10）：协同作用。这一结果与传统毒理学方法（CCK-8法）一致，验证了模型的可靠性。

此项研究能够为粮食中霉菌毒素的快速筛查与风险评估提供新工具，揭示多组分毒素的相互作用机制，推动精准毒理学发展，并且该平台可适配其他生物标志物（如蛋白质、代谢物），用于癌症诊断或药物筛选。江南大学团队通过整合荧光成像与机器学习，建立了一种高效、多靶点的霉菌毒素毒性评估平台。该技术不仅突破了传统方法的局限性，还为复杂毒性相互作用的解析提供了创新思路。未来，随着更多生物标志物的加入，这一平台有望成为食品安全与生物医学研究的重要工具。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117445