数字微流体装置自动排液，轻松实现批量化学发光免疫分析

数字微流体（DMF）是一种液体操纵技术，它利用电介质上的电润湿（EWOD）效应通过施加电压来改变液滴在疏水表面上的接触角从而实现精确操纵单个液滴，使DMF成为在纳升到微升范围内以编程方式致动液滴的适应性方法。在各种类型的生物分析中，样品预处理如分离、浓缩和纯化过程既艰巨又耗时。为了解决这个问题，实现自动化的高通量样品处理，目前部分研究已经开发出不同类别的样品预处理工作站且在减少人工处理上稍有成效，但是这些工作站往往存在占地大且消耗大量的处理试剂、工作大量集中在批量处理样品过程的缺点。而DMF技术具有小型化、低样本和试剂消耗、高度可定制以及可并行处理多个样本等优势，因此适合作为样本预处理工作站的核心技术。

已有研究证明，DMF设备可用于不同类型生物样本的预处理，但当前集成了检测功能的DMF设备在高通量处理方面存在限制，因电极在反应或检测步骤时被占用，影响了液滴操控的灵活性。此外，液体从DMF芯片传输至外部系统（chip-to-world delivery）的研究较少，现有方法包括与微通道或纸基芯片等设备连接、使用针头或发射器抽取液体、或利用毛细管结合微泵提取液体。然而，这些方法在适应性、液体操控灵活性和分析通量方面仍存在局限。针对这些问题，研究认为在DMF设备上实施耗时的反应/检测过程以实现其液体处理能力的充分利用至关重要，且需要开发一种DMF的液滴排出方法，将芯片上的样品预处理与芯片外的反应和检测相结合，从而实现灵活高效的分析。在此层面上，本研究开发了一种配备自动液滴排出的DMF样品预处理装置。

该设备采用双层DMF设计，油相填充于两层之间，并在顶层PCB板和底层ITO板上分别设置液体注入口和液体排出口。研究通过化学发光免疫分析（CLIA）进行验证，实现了样本引入、液滴转移、融合、分裂及磁珠支持的免疫反应等程序化操控，最终将CLIA反应液滴传输至排出口，并收集于微孔板中，再进行信号检测。

图1  DMF系统示意图。 （A）为CLIA开发了一种促进自动液滴排出的DMF样品预处理装置。（B） PCB分配的俯视图，显示了各种功能的电极布局。（C） 双板DMF装置接口的横截面图（未按比例）。

同以往的DMF不同，研究采用更为创新的方式即利用油包水技术，促使液滴自动从DMF装置中排出，以此来加强DMF的液体处理能力。而研究结果显示，该技术增进了DMF处理液体的能力。如装置可以在5-20μL的体积范围内通过调节注油体积和流速实现液滴的可控排空，20μL以上的体积则可以通过重力自由排出。此外，由于采用了油包水（water-in-oil）液滴和疏水涂层，液滴在排出过程中不会直接接触设备表面，避免了残留液体，确保了液滴的完整回收，液滴平均回收体积为4.94μL，回收率可达98.8%，变异系数（CV）为1.2%。

图2  A：（1）不同体积的液滴在排放口的状态；（2） 故障液滴抽空实例（以200μL/s的速度注入10μL硅油）；（3） 成功的液滴抽空实例（以100μL/s的速度注入30μL硅油）。B：油滴抽空所需的油滴体积和流速总结。

而通过对该整体DMF装置的性能进行评估，该装置展现出良好的样品预处理能力：①重复性：研究对0.5、5、10 ng/mL的PCT样本进行3次重复检测，变异系数（CV）分别为10.3%、6.4%和4.8%，说明检测重复性较好。②检测范围：CLIA信号强度在PCT浓度0.1-100 ng/mL范围内呈良好相关性，表明该方法具有较宽的动态检测范围。③检测限（LOD）：基于20例阴性血清样本的实验，确定DMF-CLIA的LOD为0.11 ng/mL，与商用Roche Cobas e602系统（LOD = 0.05 ng/mL）相当，远低于PCT的临床决策水平（0.5 ng/mL）。④交叉污染评估：采用10次交替检测空白和高浓度（10 ng/mL）样本的方法，空白样本结果始终为阴性，说明水包油液滴和疏水涂层有效防止了交叉污染。⑤与传统检测方法的一致性：对40例感染患者血清样本进行DMF-CLIA和Roche Cobas e602系统检测，二者结果高度相关（R² = 0.9766），表明DMF-CLIA的检测结果可靠，具备临床应用潜力。这些数据都表明基于液滴排出的DMF-CLIA检测效率提升。

图3  DMF-CLIA的性能。（A） 测定从DMF装置排出的液滴的回收体积。（B） 不同浓度PCT样品的测定结果的可重复性（n=3）。L（低）、M（中）和H（高）水平样品中PCT的浓度分别为0.5、5.0和10.0 ng·mL-1。（C） CLIA信号强度与PCT浓度的拟合曲线（n=3）。（D） “空白”和“H级”（10.0 ng·mL-1）PCT样品的交替分析表明，在连续样品处理中没有明显的交叉污染。

值得关注的是，研究通过液滴排出实现了无芯片检测，能够将连续样品预处理和CLIA信号检测相结合，展现出与同其他的微流控装置相比不同的优势，这些优势包括：

A、分析效率提高。这种方法允许在芯片外进行反应/检测过程的同时释放一定数量的电极，从而允许连续处理样品。与芯片上检测相比，芯片外检测的DMF-CLIA的分析效率显著提高（处理首个样本需12分钟，后续每个样本仅需3分钟，单个DMF模块每小时可处理17个样本。结合并行电极阵列设计，可进一步提高样本通量，理论上系统最高可达到每分钟20个测试）。

B、降低仪器的结构复杂性。芯片外DMF-CLIA系统有效地消除了相对于DMF设备移动探测器的需要，这一特点有助于降低仪器的整体结构复杂性。

C、避光性能。该系统中的探测器被安装在一个单独的封闭环境中，确保了符合CLIA检测的严格避光要求。

总而言之，本研究开发了一种数字微流体（DMF）样品预处理装置，利用油包水液滴技术实现了液滴的自动无残留排出。该技术有效解决了样品吸附、电极占用和污染累积问题，显著提高了分析通量和芯片使用寿命。以化学发光免疫分析（CLIA）为例，结合离芯片检测的DMF-CLIA系统，不仅提升了分析效率，还更好地满足了即时检测需求。研究结果表明，这一液滴排出功能为建立自动化、高通量、可持续的生物样品预处理工作站提供了重要技术支持，适用于大规模连续生物分析场景。