噬磁-噬菌微纳凝胶用于海产品中希瓦氏菌的超灵敏化学发光检测与原位灭活

图一：基于夹心式化学发光系统检测腐败希瓦氏菌的流程示意图。(A) P(NIPAm-co-MAA)@Phage@Isoluminol微球(piMGs)的构建；(B) MBs@Phage微球(pMBs)的制备；(C) 通过PhMS-PhMG-CL系统实现腐败希瓦氏菌的检测与灭活

腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是海产品腐败和交叉污染的主要病原体，其生物膜形成能力加剧了防控难度。传统平板计数法虽为“金标准”，但耗时长达1-3天；现有快速检测技术如PCR、生物传感器等，或依赖复杂设备，或面临化学发光效率低、信号稳定性差等瓶颈。针对上述问题，本研究创新性地开发了​​噬磁-噬菌微凝胶化学发光系统（PhMS-PhMG-CL）​​，通过多功能纳米材料协同作用，实现了腐败希瓦氏菌的高灵敏检测与原位灭活一体化。如图一所示系统核心包括：① ​​双功能微凝胶（piMGs）​​：以温/pH双响应性聚合物P(NIPAm-co-MAA)为载体，通过共价键定向固定噬菌体SPX1及异鲁米诺，赋予其特异性识别、自增强化学发光（发光峰378 nm）及抗菌功能，9小时处理可使菌量降低＞99%（初始浓度3 Log₁₀ CFU/mL）；② ​​噬磁纳米颗粒（pMBs）​​：噬菌体与Fe₃O₄偶联，兼具磁富集和类过氧化物酶活性。该系统在25分钟内可实现7.6×10¹-5.9×10⁶ CFU/mL的宽范围检测，检测限低至8 CFU/mL，并在检测后3小时内达到约97%的灭活率。实际应用中，其对养殖水、虾肉等复杂基质的回收率达90.48%-104.28%，且对非靶标菌表现出优异选择性。创新点在于：通过微凝胶共固定策略规避传统化学发光体系中纳米颗粒分散不均和发光液外添的稳定性缺陷，同时整合噬菌体精准识别、磁分离富集、仿酶催化及微凝胶环境响应特性，突破单一材料功能局限。该研究为食源性病原体的“检测-灭活”一体化提供了高效解决方案，其模块化设计可扩展至其他细菌防控领域，在食品工业和公共卫生安全中具有重要应用前景。

图二：P(NIPAm-co-MAA)与piMGs复合物的对比与表征(A) 紫外吸收光谱；(B) 荧光光谱；(C) 粒径分布；(D) Zeta电位分布；(E) P(NIPAm-co-MAA)的场发射扫描电镜图像；(F) piMGs的场发射扫描电镜图像。每列及圆点代表三次实验均值，误差线为标准差。[MG为P(NIPAm-co-MAA)微凝胶，iMGs为P(NIPAm-co-MAA)@异鲁米诺，piMGs为P(NIPAm-co-MAA)@噬菌体@异鲁米诺]

噬菌体作为天然病毒可特异性识别并依赖宿主菌（如腐败希瓦氏菌）进行复制，其尾丝蛋白能靶向结合宿主表面受体，这一特性使其成为细菌检测的理想识别元件。研究基于噬菌体SPX1（已证实对宿主菌具高特异性）构建了两类双功能探针：

（1）通过酰胺键将噬菌体SPX1与异鲁米诺共价偶联至温敏性P(NIPAm-co-MAA)微凝胶，形成复合探针piMGs。该微凝胶通过沉淀聚合法合成，FTIR光谱验证其结构（C=C键消失，NIPAm特征峰1458 cm⁻¹、1540 cm⁻¹、1649 cm⁻¹及MAA羧酸基团峰1172 cm⁻¹、1710 cm⁻¹）。微凝胶具有37.5°C的体积相变温度（VPTT，粒径从571.03 nm降至525.73 nm）及pH响应性（pH>10时结构崩解），初始羧基含量为4.6 mmol/g，偶联噬菌体与异鲁米诺后分别降至1.2 mmol/g和0.08 mmol/g，异鲁米诺最大负载率达82.9%。如图二所示piMGs的紫外吸收峰（270 nm）与异鲁米诺荧光发射峰（378→385 nm红移）证实偶联成功，其粒径由525.9 nm增至825.4 nm，Zeta电位由-32.77 mV升至-20.73 mV，且噬菌体裂解能力未受影响。扫描电镜显示偶联后微球仍保持球形（粒径由182.19 nm增至206.55 nm），表面粗糙并可见噬菌体附着（蓝色箭头）。实验进一步验证piMGs的抗菌性能（图2）：在初始菌浓度为3 Log10 CFU/mL和6 Log10 CFU/mL时，处理9小时后抑菌率分别达99.25%（降低2.11 Log10 CFU/mL）和90.90%（降低1.04 Log10 CFU/mL）。SEM图像显示经piMGs处理的细菌形态显著改变（细胞塌陷、内容物泄漏），激光共聚焦显微（CLSM）显示死菌比例显著增加（红色信号）。统计分析表明不同处理组间差异显著（P<0.05），证实piMGs能有效抑制细菌并避免检测后二次污染。

（2）将噬菌体SPX1固定于羧基化Fe₃O₄磁性纳米颗粒（MBs）表面，形成探针pMBs，其可富集目标菌并具备类过氧化物酶活性。基于piMGs和pMBs构建的PhMS-PhMG-CL检测系统通过“三明治”结构（pMBs-细菌-piMGs）实现检测：首先pMBs捕获并富集样品中的细菌（5 min），随后piMGs结合形成复合物（孵育15 min），其结合量与菌浓度成正比。优化实验表明，使用75 mM NaOH和40 mM H₂O₂可最大化化学发光信号（S/N比最优），piMGs和pMBs的最佳浓度分别为5 mg/mL和0.4 mg/mL，噬菌体与异鲁米诺体积比1:8时平衡信号强度与捕获效率。在碱性条件下，复合物结构崩解（3.5 min），pMBs催化H₂O₂分解产生活性氧（·OH），氧化反应液并双重放大化学发光信号（通过酶标仪检测）。该系统对腐败希瓦氏菌的检测限低至8 CFU/mL（S/N=3），线性范围为7.6×10¹~5.9×10⁶ CFU/mL（R²=0.9926），全程耗时25分钟，灵敏度优于多数已报道方法（如CRET策略、微流控生物传感器等）。透射电镜（TEM）显示“三明治”结构中piMGs（红色箭头）优先结合细菌，边缘深色区域（绿色箭头）为异鲁米诺，表面黑色颗粒（橙色箭头）为偶联的噬菌体。特异性测试表明，即使存在6种干扰菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌），系统对目标菌的检测信号差异仅14.63%，抗干扰能力优异。稳定性实验显示4℃保存7天后信号仅下降1.42×10⁴ RLU，重复性测试中7次实验RLU值稳定于10.41×10⁴~11.48×10⁴，证实系统可靠。实际样品（水产养殖水、白虾）加标分析显示，低、中、高浓度下的回收率为90.48%~104.28%，变异系数（CV）为0.66%~7.45%，验证了方法的实际适用性。

检测完成后，系统通过密封反应液并利用探针的抗菌功能实现即时灭活：初始浓度为10³ CFU/mL和10⁶ CFU/mL的细菌在3小时内灭活效率分别达97.34%和97.01%（菌落数分别从3.21 Log10降至1.74 Log10，6.71 Log10降至5.23 Log10），CLSM图像显示死菌比例显著增加（图三）。该策略确保检测后样品无二次污染风险，且灭活过程不影响检测准确性（因“三明治”结构中的探针数量固定）。综上，PhMS-PhMG-CL系统整合了特异性识别、信号放大、抗干扰、稳定性及检测后即时灭活功能，为食品和环境样品中腐败菌的快速灵敏检测与防控提供了高效解决方案。

图三：PhMS-PhMG-CL 的性能评价。（A） 夹心复合物形成的 TEM 图像检测腐败链球菌。（B） 特异性。（C） 在 106 CFU/mL 下检测腐败链球菌的稳定性。（D） 检测 106 CFU/mL 腐臭链球菌的重现性。每列和每个点表示三个实验的平均值，误差线表示标准差。通过单因素方差分析 （ANOVA） 和 Duncan 多重比较评估统计显着性。（***P < 0.001，ns：不显著）

本研究构建的PhMS-PhMG-CL检测系统通过整合智能微凝胶（piMGs）与磁性探针（pMBs），实现了腐败希瓦氏菌的高效检测与即时灭活。piMGs基于温敏性P(NIPAm-co-MAA)微凝胶负载噬菌体SPX1和异鲁米诺，兼具特异性捕获、抗菌及化学发光功能；pMBs通过羧基化Fe₃O₄磁性颗粒固定噬菌体，可富集目标菌并催化信号放大。该系统采用“三明治”结构（pMBs-细菌-piMGs），在碱性条件下释放高浓度异鲁米诺（信号强度提升约3.3倍），pMBs催化H₂O₂产生活性氧（·OH）双重放大化学发光信号，无需外源发光试剂即可在25分钟内完成检测，检测限低至8 CFU/mL，线性范围7.6×10¹~5.9×10⁶ CFU/mL。检测后，噬菌体SPX1对初始浓度10³ CFU/mL和10⁶ CFU/mL的细菌灭活效率分别达97.34%和97.01%，有效防止二次污染。该系统融合特异性识别、信号放大、快速检测与即时灭活功能，为复杂基质中腐败菌的灵敏检测及生物防控提供了创新策略，具有广泛的实际应用潜力。

原文doi: https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.162267