磁性等离子体黑体增强葡萄球菌肠毒素B侧流免疫测定

1. 引言

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛存在于高水分食品中，通过产生葡萄球菌肠毒素（SEs）引起食物中毒。SEs的主要血清型包括SEA、SEB、SEC、SED和SEE，其中SEB具有最高的热稳定性。传统的SEs检测方法如PCR、液相色谱-质谱法和ELISA，虽然有效，但成本高、耗时长，需要复杂设备。侧流免疫分析法（LFIA）因其简单、快速、成本低而广泛应用于食品安全监管。然而，传统的金纳米颗粒（AuNPs）作为信号探针的LFIA灵敏度较低。近年来，磁性颗粒、发光材料等新型信号报告器被开发以提高灵敏度，但通常需要额外设备。磁性纳米颗粒与AuNPs的结合有望创造磁性比色双功能复合材料，但仍面临挑战，如低浓度AuNPs的增强效果不明显和磁屏蔽效应。因此，设计新型高灵敏度的GMNPs仍是一个重大挑战。

本研究报道了一种通过利用磁等离子体黑体（Fe₃O₄@Au/PDA）开发了一种增强型LFIA，用于快速灵敏地检测SEB。采用原位氧化还原-氧化聚合法制备了单分散的Fe₃O₄@Au/PDA核/壳纳米结构。350μL样品溶液中加入3μL Fe₃O₄@Au/PDA@mAbs。孵育5分钟后，利用外磁场分离形成的Fe₃O₄@Au/PDA@mAbs-SEB免疫复合物和游离的Fe₃O₄@Au/PDA@mAbs。沉淀用80 μL PBS重悬，进行LFIA检测。然后将得到的混合物移液到试纸的样品孔中。运行5min后，使用便携式光密度条带仪记录T线（ODT）和C线（ODC）上的光密度（OD）。

方案1. 用于SEB检测的Fe₃O₄@Au/PDA LFIA示意图。(A) Fe₃O₄@Au/PDA的优点包括宽带吸收、快速磁响应和优异的胶体稳定性。(B)磁选程序示意图。(C) Fe₃O₄@Au/PDA LFIA检测过程示意图。

2. 结果与讨论

Fe₃O₄@Au/PDA的合成与表征

研究人员通过原位氧化还原-氧化聚合法制备了单分散的Fe₃O₄@Au/PDA核/壳纳米结构。首先，使用溶剂热法获得了分散良好的Fe₃O₄纳米球，平均粒径约为190 nm。然后，通过超声波处理，将HAuCl₄和多巴胺引入，形成Au/PDA杂化体，包覆在Fe₃O₄纳米球表面，形成Fe₃O₄@Au/PDA核壳纳米结构。TEM和EDX元素映射证实了Au/PDA杂化涂层的形成，Au不均匀地分布在Fe₃O₄纳米球的表面。

图1. Fe₃O₄@Au/PDA的合成与表征

研究人员通过动态光散射分析了Fe₃O₄@Au/PDA纳米球的制备过程，发现其高分辨度比Fe₃O₄芯增加了63 nm。Zeta电位分析显示Fe₃O₄@Au/PDA的电位降低，胶体稳定性增强。磁滞回线测量表明Fe₃O₄@Au/PDA表现出超顺磁性，尽管饱和磁化强度降低，但仍能快速磁分离。通过优化抗体偶联条件，Fe₃O₄@Au/PDA@mAbs探针的制备实现了高效抗体偶联和稳定性。

图2. Fe₃O₄@Au/PDA的性质表征

Fe₃O₄@Au/PDA LFIA检测方法的开发与优化

研究人员使用ELISA评估了Fe₃O₄@Au/PDA的抗体偶联效率，结果显示其共轭效率为87.47%。该探针在长期储存中表现出显著的稳定性。通过优化T线上抗体浓度和探针数量，检测效果得到改善。最佳条件为T线浓度2 ng/mL和添加4 μL探针。样本量和磁吸附时间的平衡使得350 μL样本和5分钟的分离时间被选用。免疫反应动态曲线表明5分钟的反应时间足以实现快速筛选检测。

图3. Fe₃O₄@Au/PDA@mAbs标签参数的优化

Fe₃O₄@Au/PDA LFIA检测SEB的分析性能及实际应用

Fe₃O₄@Au/PDA用于SEB检测的LFIA展示了优异的分析性能。该方法在T线和C线处显示出明显的黑色带，与白色背景形成鲜明对比。检测限（LOD）为0.19 ng/mL，随SEB浓度增加而呈线性关系。与传统的AuNPs-LFIA相比，Fe₃O₄@Au/PDA的灵敏度提高了41倍。特异性测试表明，只有SEB存在时才会产生显著的比色信号，其他物质的反应可忽略不计。

图4. 应用Fe₃O₄@Au/PDA LFIA和AuNPs LFIA检测SEB

Fe₃O₄@Au/PDA LFIA在牛奶、奶粉、苹果汁和生菜等食品样品中表现出良好的SEB检测能力。随着SEB浓度增加，ODT/ODC值呈线性关系，检测限分别为0.39 ng/mL（牛奶、奶粉、生菜）和0.78 ng/mL（苹果汁）。回收率实验表明该方法准确可靠，CV值在1.41%至12.6%之间。与ELISA方法的比较显示两者高度一致，相关系数为0.9921。该方法在检测时间、成本和便携性方面优于ELISA。

图5. Fe₃O₄@Au/PDA LFIA分析性能评价

3. 总结

本研究设计了一种新型的Fe₃O₄@Au/PDA磁等离子体黑体，并将其应用于免疫层析检测（LFIA）中，用于复杂食品样品中SEB的灵敏检测。这种材料因其快速的磁响应、优异的稳定性、高摩尔消光系数以及在白色背景下强烈的颜色对比度而被选中。与传统的AuNP标签相比，Fe₃O₄@Au/PDA的检测限（LOD）低至0.19 ng/mL，约比传统AuNP LFIA低41倍。该方法在牛奶、奶粉、苹果汁和生菜等被人工污染的食品样品中进行了验证，证明了其准确性、稳定性、可靠性和实用性。Fe₃O₄@Au/PDA在减少样品基质干扰和增强信号输出方面具有显著的优势，在开发超灵敏免疫层析检测平台方面具有很大的潜力。未来研究的趋势可能集中在进一步优化纳米材料的性能，以提高灵敏度、稳定性和用户友好性，并与便携式设备或智能手机集成以实现实时、现场的食品安全评估。此外，将LFIA扩展到同时检测多种分析物也是一个有希望的方向。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.142130