纳豆激酶“赋能”细胞培养，细胞农业与再生医学新希望

细胞农业旨在通过细胞和组织培养技术开发动物产品，但传统培养过程中常需使用动物源成分，如胎牛血清、猪源明胶等。细胞传代时，常用从猪胰腺提取的胰蛋白酶来分离细胞，但其动物来源属性限制了其在商业培养肉生产中的应用。此外，现有重组胰蛋白酶类似蛋白酶TrypLE未获食品应用授权且成本较高。纳豆激酶是芽孢杆菌亚种纳豆发酵产物，具有食品级、价格实惠等优势，且已被欧盟批准为食品补充剂，其在组织工程领域已有应用。

近期，比利时鲁汶大学和根特大学的研究团队发现，纳豆激酶（nattokinase）有望成为一种新型食品级细胞分离酶，为细胞长期传代培养提供新选择。相关研究成果发表于《Food Research International》杂志。

研究内容

图 1 三种浓度的纳豆激酶溶液的SDS-PAGE分析

图1展示了三种不同浓度（20FU/ml、10FU/ml、5FU/ml）纳豆激酶溶液的SDS-PAGE分析结果。图中出现了两条主要蛋白条带，分别位于36.2kDa和27.7kDa。36.2kDa的条带代表纳豆激酶的前肽-链复合体，而27.7kDa的条带代表单独的酶链。这表明纳豆激酶溶液中主要含有这两种蛋白成分，且与已知的纳豆激酶结构一致，说明其纯度较高，适合用于后续的细胞分离实验。

图 2 每种细胞类型的分离方法优化

研究人员分别对牛成肌细胞、间充质基质细胞（MSCs）和人类胚胎细胞系（H9）进行了实验。在优化解离实验中（图2），可以直观地看到不同细胞类型在不同的纳豆激酶浓度和孵育时间下的解离效果。起初，研究人员用高浓度（50FU/ml）的纳豆激酶测试不同解离时间，结果显示，15-60秒的处理让牛成肌细胞接近最大程度的脱离，但较短孵育时间后显微镜下可见有细胞残留；90-120秒对牛MSCs较为适宜，但时间短也会有细胞残留；4-7分钟能让H9细胞达到接近最大脱离效果，不过4分钟时还有细胞团块残留。综合考虑，后续实验选择60秒处理牛成肌细胞、120秒处理牛MSCs、5分钟处理H9细胞。

在测试纳豆激酶浓度时，研究人员发现，1-20FU/ml对牛成肌细胞、10-50FU/ml对牛MSCs、1-50FU/ml对H9细胞的活细胞计数没有显著差异，但低浓度时会有细胞残留，所以后续实验选择20FU/ml用于牛成肌细胞、50FU/ml用于牛MSCs、10FU/ml用于H9细胞。在测试酶抑制的必要性时，结果表明，只有用含FBS的培养基抑制纳豆激酶，才能在60分钟内完全保持牛成肌细胞和牛MSCs的活力，而大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）则无法达到类似效果；H9细胞在含E8培养基抑制的纳豆激酶中能保持活力，但未抑制时活力下降。

图 3 纳豆激酶传代对肌原纤维细胞的长期影响

从图3中可以看出，牛成肌细胞用纳豆激酶和胰蛋白酶传代7次后，平均群体倍增数分别为21.2（±2.3）和22.3（±1.4），二者无显著差异，但用纳豆激酶传代的细胞在第6代时CD56+细胞比例显著更高（88±3% vs 73±5%，p=0.03，n=6）。

图 4 纳豆激酶传代对间充质基质细胞（MSCs）的长期影响

图4展示了牛MSCs的实验结果，用纳豆激酶和胰蛋白酶传代对其增殖没有显著影响，在三系分化能力方面，不同处理组之间也没有显著差异。

图 5 纳豆激酶传代对H9细胞系的长期影响 

图5呈现了H9细胞的实验数据，用纳豆激酶和TrypLE传代10次后，H9细胞的平均群体倍增数分别为31±0.3和30±1，无显著差异，并且H9细胞在用纳豆激酶传代6次后仍能保持多能性，进行三系分化。

可见纳豆激酶是一种有效的细胞分离酶，适用于多种细胞类型的长期传代培养。它具有与胰蛋白酶相当的细胞分离效率，且在细胞增殖、分化潜能保持等方面表现良好。此外，纳豆激酶作为食品级酶，成本较低，安全性高，其在细胞农业和再生医学中的应用前景广阔，有望成为培养肉生产中动物源胰蛋白酶的理想替代品，推动相关领域向更可持续、更符合食品安全要求的方向发展。

这项研究为细胞培养领域提供了新的选择，也为细胞农业和再生医学的发展带来了新的机遇。随着对纳豆激酶研究的不断深入，相信它将在未来的细胞培养应用中发挥更大的作用。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodres.2025.115800