大规模的多模态单细胞测序

单细胞测序技术近年来在生物医学研究中取得了突破性进展，尤其在揭示细胞异质性、解析复杂疾病机制和探索发育动态过程中展现出独特优势。然而，传统单细胞测序方法受限于三大技术壁垒：1）模态特异性实验设计导致平台兼容性差；2）单轮索引系统通量受限（常规碰撞率>5%）；3）临床样本处理成本高昂。由于目前单细胞测序技术存在通量低、成本高、样本兼容性有限等问题，限制了其在大规模临床研究和高通量筛选中的应用。

近日，《Nature Methods》报道了由Yun Li和Zheng Huang团队研发的通用型液滴微流控组合索引技术UDA-seq（Universal Droplet Microfluidics-based Combinatorial Indexing）。该技术创新性地整合液滴微流控与组合索引策略，显著提升了单细胞分析的吞吐量和经济性，同时兼容多种模态和临床样本，为单细胞技术的规模化应用提供了重要手段。

和以往的单细胞测序不同的是，UDA-seq的核心创新在于其“双轮组合索引”设计，通过液滴微流控系统（第一轮索引）与孔板后索引（第二轮索引）的结合，实现了超高通量的单细胞标记：①液滴内标记（第一轮索引）：固定或透化后的细胞或细胞核被封装至液滴微流控系统中，在液滴中对细胞或者细胞核进行条形码标记，包括RNA、ATAC、CRISPR等多种模态。②液滴释放与孔板后索引（第二轮索引）：打破液滴乳液，释放条形码标记过的细胞/细胞核核，释放的细胞或细胞核被随机分配至96/384孔板，通过孔特异性PCR引物对每孔进行第二轮条形码标记。两轮条形码组合形成唯一标识，随后通过测序解析单细胞来源的多组学数据。

图1  UDA-seq工作流程包括两轮条形码。

为了验证UDA-seq技术的可靠性，研究团队首先构建了HeLa人源细胞系与NIH3T3小鼠细胞系双物种等比例混合实验，采用3'-RNA UDA-seq技术成功捕获6245个高质量单细胞转录组，其捕获效率为62%，碰撞率显著降低至1.23%，较单轮索引的预期碰撞率6.29%显著降低。当实验拓展至三物种（人、小鼠、蝗虫）混合实验时，碰撞率进一步降至0.67%。这表明该技术显著降低单细胞RNA测序中因两个细胞被错误封装在同一液滴导致的混合信号的发生，展现出UDA-seq技术在跨物种单细胞多组学分析中的有效性以及对不同物种的细胞进行标记、区分以及多组学信息获取的准确性。该技术具有在多组学分析中精确区分异源细胞核的能力，为复杂样本分析提供了技术保障。

图2 跨物种混合实验 （a）单核3′-RNA UDA-eq具有16个孔后索引。（b）单核scm多组UDA-eqs具有16个孔后索引。（c）Violinplots显示了UDA-seqcMultiome和10x Genomics。

为了进一步评估UDA-seq的多组织与临床样本的性能测试，研究通过多维度实验验证UDA-seq技术在复杂生物医学场景中的应用价值。对35例冷冻肾脏样本（25例患者+10例健康对照）进行多组学分析，获得207789个高质量单核数据集，平均每个细胞检测到1707个基因和9881个染色质开放区域（图2c）。

图3 人类肾脏微型活检的单核RNA和ATAC联合分析。  a）Multiome UDA-seq的数据质量，显示了疾病患者（n=25）和健康对照供体（n=10）的每细胞基因数（左上）和每细胞FiRP（右上）的分布。方框图显示了四分位数间距，中位数标记。左下：疾病患者和健康供体的转录起始位点周围的标准化插入曲线。右下：来自疾病患者和健康供体的片段长度分布。

对38名女性PBMC样本进行5'-RNA与VDJ联合分析，识别出44种免疫细胞亚型，包括仅占0.36%的γδT细胞。这些结果显示UDA-seq在多种原代组织和临床样本中展现出与商业化试剂盒（如10x Multiome）相当的数据质量。但是与10x Genomics相比，UDA-seq的文库构建成本降低8-9倍（单细胞）或15-20倍（单样本），尤其适合大规模队列研究。例如，单次实验可分析300000个PBMC细胞，回收170,000个高质量细胞，测序深度50,000 reads/细胞时，中位基因数达1296个。

图4  UDA通量  a）scVDJ-seq中UDA与10x Genomics的比较。Next GEM（Kit_v2）和GEM-X（Kit_v3）以及10x Next GEM的T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）检测比值。 b）对来自单个供体的超过150,000个细胞进行超高通量5′-scRNA UDA-seq分析，鉴定出44种不同的细胞类型。UMAP图用颜色编码表示这些细胞类型。

此外UDA-seq技术在临床应用与机制发现上颇有成效：

1. 肾脏疾病多组学分析

通过UDA-seq分析肾脏活检样本，研究团队揭示了蛋白尿和肾功能损伤的细胞机制。应用Scissor算法，UDA-seq可以识别占比仅0.6%的病理相关足细胞亚群（PODs），其亚群1呈现TGF-β信号通路的特异性激活（图3a-g），揭示该通路通过诱导上皮-间质转化推动肾小球纤维化进程。 在肾功能受损（eGFR降低）样本中，研究还发现肾小球毛细血管内皮细胞（EC-GC）与免疫代谢损伤存在显著关联，SCENIC+分析揭示出KLF12/RARB协同调控CCND3、PTK2B等免疫损伤相关基因。

图5 使用UDA-seq识别出与损伤相关的罕见细胞亚群  a）在六个子簇中由SCENIC+识别的重要eRegulons。热图的颜色表示缩放后的转录因子基因表达量，点的大小表示缩放后的靶区域富集度。b）GRNs揭示了子簇3的关键eRegulons，该子簇由与免疫功能障碍相关的细胞组成。转录因子以加粗并放大基因符号表示，峰值区域用方块表示，受调控的基因显示在图的边缘。c）由b中转录因子调控的代表性基因在子簇3中高表达。

2.免疫衰老研究

在PBMC老化队列中，UDA-seq结合VDJ分析发现：NK细胞、γδT细胞和CD8+ TEM细胞都随着年龄增长显著富集。值得注意的是，UDA-seq分析发现CD4+ naïve T细胞中ITGB1+ PREX1+亚群比例随年龄增长而累积（P<0.05），而TCR克隆多样性在老年组显著下降（逆辛普森指数降低，P<0.05），克隆扩增程度增加，反映出免疫衰老的特征性变化。

图6 研究老年女性队列中的PBMC特征。 a）显示与年龄相关的细胞组中细胞类型比例的饼状图。顶部：与年龄正相关的组。底部：与年龄负相关的组。 b）CD4初始细胞的重新聚类，揭示了九个亚簇。 c）CD4幼细胞亚簇2的比例随年龄增长而增加。 d）箱线图显示了不同年龄段的TCR克隆多样性，每个点代表通过逆辛普森指数计算出的供体多样性。箱线图显示了四分位数范围，并标出了中位数。须线延伸至四分位数范围的1.5倍。

3. CRISPR筛选应用

此外，研究使用UDA-seq联合CROP-seq进行大规模CRISPR筛选，使得分析CRISPR介导的扰动成为可能。研究通过编码255个单向导RNA（sgRNA）的慢病毒构建体转导表达Cas9的SNU16细胞，利用sgRNA靶向溴结构域和额外末端结构域（BET）家族蛋白中的46个基因，以此分析SNU16胃癌细胞中255个sgRNA的敲除效应。研究结果显示，每个sgRNA平均覆盖44个细胞，每个目标基因覆盖233个细胞（每个目标基因由5个sgRNA靶向），最终数据显示，每个细胞检测到的基因数中位数为1745个，UMI数中位数为2497（扩展数据图9c)。充足的细胞覆盖（sgRNA和基因水平）及高质量的单细胞数据（高基因/UMI检出），确保了CRISPR筛选结果的可靠性，符合领域内典型要求。此外，研究还揭示了BET家族基因（如BRD4）敲除使MYC表达降低40-60%（调整后P<0.05）的发生，识别出BET家族调控的不同癌细胞亚群的敏感性。

综上所述，UDA-seq是一种突破性的单细胞多组学测序技术，该技术首先在液滴内标记细胞核酸，释放后通过96/384孔板进行二次条形码标记，形成唯一标识符，实现单次实验百万级细胞的低碰撞率（<2%）分析，且兼容转录组、表观组、免疫组和CRISPR扰动等多模态联合检测。其未来可推动大规模疾病图谱构建、药物靶点筛选及细胞“语言模型”开发，成为精准医学研究的核心工具。此外，通过结合组合索引与微滴微流控系统，实现了高通量、低成本和高可靠性分析，尤其适用于临床冷冻样本如PBMC、肾脏活检和肿瘤样本。其数据质量不仅与商业化10x Genomics试剂盒相当，且可以成功识别出罕见细胞亚群如千分之五以下的衰老相关γδT细胞和蛋白尿相关POD细胞。其创新性后索引策略克服了传统预索引方法的局限性，可兼容现有多模态检测技术如CITE-seq、sn-m6A-CT和10x Genomics系统升级，同时支持DNA标记抗体等样本复用方案。相较于同类方法OAK-seq的体外系统应用，UDA-seq在临床规模研究像疾病队列、细胞图谱构建、CRISPR筛选和药物开发领域具备四大核心优势：①超高通量：双轮索引实现百万级细胞分析（碰撞率<2%）。②多模态兼容：支持转录组/表观组/免疫组/CRISPR扰动联合检测。③临床适配性：突破冷冻样本处理瓶颈，支持CITE-seq等系统升级。④成本效益比：单次实验成本降低80%以上。其通过减少批次效应和提升细胞捕获深度，为大规模单细胞研究提供了标准化解决方案，该技术的通用性和可扩展性将推动单细胞多组学研究进入新的发展阶段。

原文链接：DOI: 10.1038/s41592-024-02586-y