荧光探针揭秘：StrH在生物膜与凋亡中的新视角

1. 引言

肺炎链球菌感染是全球主要的健康问题，每年导致大量死亡。生物膜的形成增加了治疗的复杂性，因为它们保护细菌免受抗菌剂的影响。StrH是一种肺炎链球菌的毒力因子，通过去糖基化作用促进免疫逃避和细菌生长。然而，其在生物膜形成中的确切机制尚不清楚。开发新的分子工具来检测StrH活性对于确定新的治疗靶点至关重要。热激活延迟荧光（TADF）探针在检测和可视化细胞过程中非常有效，具有长寿命荧光，可以提高信噪比和检测质量。设计用于生物成像和传感的长寿命荧光探针是一个新兴的研究领域，有助于探索StrH在生物膜形成中的作用。

本研究报道了一种名为“HBT-PXZ-St”的探针，以检测StrH活性并探索其在生物膜形成和宿主细胞相互作用中的作用。该探针通过在“HBT-PXZ”的酚羟基上引入亲水的N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺基，作为特定的识别单元。StrH通过糖水解激活探针，导致其在水溶液中聚集并发出荧光信号，从而使StrH活性可视化。使用荧光寿命成像（FLIM），研究人员在活的肺炎链球菌细胞中定量了StrH活性，获得了约2微秒的荧光寿命。结果表明，StrH在促进生物膜形成中起重要作用，有助于逃避宿主细胞的防御。此外，StrH通过RIPK1通路诱导A549宿主细胞坏死，从而促进细菌的入侵和传播。

方案1. 设计StrH触发的时间分辨荧光探针，用于探索肺炎链球菌StrH在生物膜形成和宿主细胞坏死中的双重功能。

2. 结果与讨论

strh触发DF探针的设计、合成及表征

“HBT-PXZ-St”是一种通过在“HBT-PXZ”的酚羟基上引入亲水性n-乙酰基-β-d-葡萄糖胺基而开发的探针。它既是StrH识别片段，又是ESIPT-DF阻断剂。通过StrH的糖水解，“HBT-PXZ-St”被激活，在水溶液中聚集并发出荧光信号，从而可视化StrH的活性。分子对接计算显示，“HBT-PXZ-St”与StrH通过π-π相互作用和氢键结合，具有高亲和力。荧光实验表明，“HBT-PXZ-St”对StrH具有高灵敏度和特异性，适用于体外检测。其在生理条件下稳定，且具有低细胞毒性。

图1. HBT-PXZ-St的合成、表征及其对StrH的光学响应。

活细胞中StrH活性成像

“HBT-PXZ-St”因其高特异性、稳定性和低细胞毒性，被认为是监测活细胞中StrH活性的有效工具。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察活的肺炎链球菌细胞，发现“HBT-PXZ-St”孵育后产生强烈荧光信号。荧光寿命成像显示出明亮、长寿命的荧光发射，平均寿命为2.2µs。StrH抑制剂PUGNAc预处理后，荧光强度和寿命均降低，证实StrH的活性触发了“HBT-PXZ”的原位释放和聚集，伴随延迟荧光增强。这种长寿命信号提高了信噪比，减少了自身荧光干扰。

图2. “HBT-PXZ-St”在细胞水平对StrH的响应的CLSM和FLIM图像。

StrH抑制剂和Zn2+螯合对肺炎球菌生物膜形成的抑制作用

“HBT-PXZ-St”探针用于评估肺炎链球菌生物膜中StrH的作用。结果显示，“HBT-PXZ-St”能有效穿透并可视化生物膜。通过抑制剂PUGNAc和Zn2+螯合剂DTPA，StrH活性降低，导致生物膜形成减少。Zn2+螯合抑制了生物膜生长，表明StrH在Zn2+依赖性生物膜形成中发挥关键作用。这些发现突出了StrH在肺炎链球菌持续感染中的重要性。

图3. StrH抑制剂和Zn2+螯合均能抑制肺炎链球菌的生物膜形成。

StrH处理A549细胞的RNA-Seq分析

StrH在生物膜形成中可能作为防御机制。宿主-病原体相互作用对于生物膜形成至关重要，但StrH是否直接参与此过程尚不明确。A549细胞中未观察到StrH活性，因此用于研究宿主-病原体相互作用。RNA-seq分析显示，StrH处理导致355个基因表达变化，涉及免疫相关通路，如TNF、IL-17、MAPK和NF-κB信号通路。StrH可能促进宿主细胞死亡，影响宿主与肺炎球菌的相互作用。

图4. 经或不经StrH处理的A549细胞的RNA-seq分析。

StrH通过RIPK1信号通路诱导A549细胞坏死

StrH诱导的A549细胞死亡主要表现为坏死，而非凋亡。通过YO-PRO-1和PI染色，观察到细胞膜破坏增加，红绿荧光增强。铁下垂未发生，ROS和脂质ROS水平保持不变。StrH促进了坏死的激活，通过MLKL和RIPK1磷酸化参与坏死性坏死的机制。这些发现表明，坏死是StrH诱导细胞死亡的主要方式。

图5. StrH处理诱导A549细胞坏死。

3. 总结

本研究设计了一种基于StrH激活的新型探针“HBT-PXZ-St”，用于检测和成像肺炎链球菌中的StrH活性。该探针通过增强光强度和寿命信号，选择性地响应StrH，实现了活的肺炎链球菌细胞和生物膜中StrH的实时成像。它具有良好的选择性和低细胞毒性，是监测StrH活性的有效工具。研究表明，StrH在肺炎球菌生物膜的形成中起着至关重要的作用，抑制StrH活性可以抑制生物膜的形成。这一发现揭示了StrH介导的生物膜发育可能作为抵抗宿主免疫反应的防御机制，并增强抗生素耐药性。此外，研究人员发现StrH可以诱导RIPK1介导的A549细胞坏死，可能促进肺炎球菌进一步侵袭和全身感染。这些发现为StrH在肺炎链球菌定植和宿主细胞入侵中的“剑和盾”双重功能提供了重要的见解，突出了它作为抗肺炎链球菌感染的有希望的治疗靶点。通过开发这一探针，研究人员为准确诊断和创新治疗策略的发展提供了新方案。

原文链接：https://doi.org/10.1002/adhm.202404252