CRISPR-Cas12a激活的磁性SERS传感器：双模式检测新时代

1. 引言

核酸检测在生物化学分析中至关重要，尤其是在疾病诊断、食品检测和环境监测方面。表面增强拉曼散射（SERS）因其高灵敏度和抗光漂白性而受到关注。SERS与其他方法（如比色法）结合的双模检测可以提高灵敏度和实用性。CRISPR-Cas12a系统因其酶切能力被广泛应用于核酸扩增和生物传感器中。磁性介孔二氧化硅微球（Fe₃O₄@mSiO₂）因其易磁分离和多功能性，在生物传感和药物递送领域得到广泛研究。通过CRISPR-Cas12a系统建立的释放装置可以提高检测灵敏度。这些技术的集成有助于开发高灵敏度、多模式的生物传感器。

本研究选择了过表达于多数肿瘤细胞中的microRNA-21（miRNA-21）作为核酸检测的模型靶点，并利用磁性介孔二氧化硅微球Fe₃O₄@mSiO₂构建了一种无标记的CRISPR/Cas12a响应生物传感器。该传感器中，将拉曼分子亚甲基蓝（MB）包裹在环氧基修饰的Fe₃O₄@mSiO₂的介孔中，并将氨基修饰的g-四重体/血红蛋白复合物共价结合到微球表面作为中孔阻断帽。在识别部分，引入了引物交换反应（PER）级联，从PER发卡开始。靶标miRNA-21存在时，可以通过竞争结合与保护链杂交，释放未锁定的模板发卡。然后，引物与模板发卡杂交并延伸，形成重复序列的PER产物。这些产物与多个crRNA杂交，激活Cas12a蛋白酶，进而剪切与g-四重体连接的单链DNA，导致拉曼分子MB的释放。释放的MB被收集并滴在合成的拉曼底物ZnO NRs@Au NPs上进行SERS分析。同时，释放的g-四重体/hemin作为DNAzyme，可以催化H₂O₂氧化2,2'-氮化萘，产生绿色产物ABTS·⁺，实现了“信号开启”和双模SERS比色传感平台。这种方法不仅提高了检测灵敏度，还提供了多模式信号输出。

方案1. 基于CRISPR/Cas12a和PER扩增的SERS和比色双模检测示意图

2. 结果与讨论

Fe₃O₄@mSiO2微球的表征

研究人员通过透射电镜表征了磁性介孔材料，发现Fe₃O₄微球呈均匀球形，粒径约为230 nm。Fe₃O₄@mSiO₂微球的粒径增加到280 nm，呈现核壳结构。XRD和N2吸附/脱附等温线分析显示，材料具有典型的介孔二氧化硅通道，表面积和孔体积分别为701.48 m²/g和0.67 cm³/g。FT-IR和Zeta电位分析证实了材料的成功修饰。磁性材料具有良好的磁响应，适用于刺激-响应传感分析。

图1. Fe₃O₄@mSiO₂微球的表征

可行性分析

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了PER扩增的可行性，miRNA-21触发模板发夹释放并形成长链PER产物，激活Cas12a蛋白酶切割F-Q报告基因，荧光显著增强。Cas12a仅切割与g-四联体相连的单链DNA，确保比色检测稳定性。SERS分析显示ZnO NRs@Au纳米粒子对亚甲基蓝的拉曼信号增强因子达5.185×10⁵。荧光、Zeta电位和电泳实验证实Cas12a可切割Fe₃O₄@mSiO₂表面的DNA帽，验证了检测系统的有效性。

图2. 可行性分析

实验条件优化及miRNA-21双信号检测

研究人员优化了PER和CRISPR/Cas12a反应条件，实现了高灵敏度的miRNA-21检测。SERS信号与miRNA-21浓度的对数呈线性关系，检测限为4.2 aM。比色检测在0.5 fM ~ 100 pM范围内也呈线性关系，LOD为0.18 fM。该方法结合了SERS和比色两种检测方式，提高了灵活性和灵敏度，SERS的灵敏度明显高于比色法。与其他方法相比，该SERS检测的灵敏度提高了数倍。

图3. miRNA-21的双信号检测。

检测特异性和重复性

在不同浓度的miRNA-21下，SERS信号随着miRNA-21浓度的增加而增加。具体来说，SERS信号与miRNA-21浓度的对数呈线性关系，线性方程为I=1737.6lgCmiRNA-21+30939，其中I表示1625 cm^-1处的峰值强度，C为miRNA-21的浓度。这种线性关系表明，随着miRNA-21浓度的升高，SERS信号也会相应增加，直到达到检测限（4.2 aM）。

图4. 检测特异性和重复性

研制的生物传感器的实际应用

研究人员通过标准添加法在人血清中验证了传感平台的定量分析能力，miRNA-21的加样回收率为94.0% ~ 105%。然后，他们比较了不同数量的MCF-7和HEK 293 T细胞裂解液中的miRNA-21含量。结果显示，随着MCF-7细胞数量增加，SERS信号升高，而HEK 293 T细胞中的信号非常低。这一趋势在比色分析中得到验证，表明该双模传感器适用于实际样品检测。

图5. 不同数量的MCF-7和HEK239T细胞裂解物

3. 总结

本研究设计了一种基于CRISPR/Cas12a的Fe₃O₄@mSiO₂传感平台，用于miRNA-21的无标记双模检测。该平台利用靶向启动的引物交换反应（PER）和CRISPR-Cas12a系统来提高检测灵敏度。激活的CRISPR-Cas12a通过反式切割促进了覆盖在Fe₃O₄@mSiO₂上的g-四重体的去除，从而释放了负载在磁性介孔二氧化硅微球中的亚甲基蓝（MB）分子。释放的MB分子可用于表面增强拉曼散射（SERS）分析，而g-四重体/hemin复合物可用于比色检测。总的来说，这项工作提出了一个敏感的、无标签的、双模式和通用的分析方法。开发的传感器有望检测各种核酸或分子，只需改变PER发卡DNA或与核酸适体结合，从而在各种应用中显示出巨大的潜力。然而，该方法的主要缺点是需要分别完成PER周期和CRISPR/Cas12a系统扩增，导致检测时间较长。未来研究可以集中在提高检测效率上，以进一步优化该方法。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.136452