1. 引言

公共卫生面临着严重的细菌感染威胁，需要准确、灵敏的检测方法。传统的培养法和免疫测定法存在局限性，而PCR方法需要DNA扩增。液滴数字PCR提供了绝对定量，但受设备昂贵和复杂工艺的限制。因此，开发一种无需DNA扩增、多路检测的方法至关重要。聚合物荧光点因其超亮光致发光和优异的光稳定性，成为制备高亮度荧光探针的理想选择。聚苯乙烯纳米球具有良好的物理性能，适合作为荧光探针的载体。引物交换反应（PER）可以通过自组装增加DNA结合位点，实现信号放大。利用PER介导的荧光点进行多重检测，有望解决当前检测方法的局限性。

本研究报道了一种通过一步热解策略合成具有大孔壁、集成CoS和CoFe多掺杂纳米颗粒的中空泡沫碳（CoS-FeCo-HSNC）。该数字分析流程由四个核心模块组成（图1a-d）。第一模块为数字信号探针预处理，涵盖DNA-PER链、DNA-PS-dots及DNA-LP-MB的制备。其中，DNA-PER链与DNA-PS-dots通过杂交反应形成类植物状荧光聚合物点（PER-PS-dots），其荧光特性为后续分析提供标记基础。第二模块基于丁酸梭菌Argonaute蛋白（CbAgo）与六种引导DNA（gDNAs）的协同作用，实现对三种致病菌DNA的特异性初切反应。值得注意的是，每种致病菌由两种光谱相近的gDNAs进行双靶点识别，以提高检测特异性。第三模块通过DNA-LP-MB与裂解靶序列、PER-PS-dots的级联杂交反应完成荧光编码：裂解产物中部分靶序列与DNA-LP-MB表面探针互补结合，其余序列则作为桥梁连接PER-PS-dots，形成复合探针-信号放大体系。第四模块整合数字荧光显微成像、图像处理及人工智能算法，实现高灵敏度信号解析与目标病原菌的数字化定量分析。该流程通过模块化设计将生物分子识别与纳米材料信号转换相结合，为多重病原检测提供了高精度解决方案。

图1. 多路检测病原体的数字分析概述。

2. 结果与讨论

数字探头的特性

本研究以鼠伤寒沙门氏菌为例，利用引物交换反应（PER）和荧光聚苯乙烯点（PS-dots）进行数字检测。通过凝胶电泳验证了PER链的成功扩增。PS-dots在预膨胀时间和浓度优化后，显示出良好的荧光稳定性和储存稳定性。将DNA修饰到PS-dots表面后，通过凝胶电泳和荧光显微镜表征，证明了DNA修饰的成功。脂质体修饰的微球（LP-MBs）与DNA结合后，与PER-PS-dots杂交，形成了可行的检测策略。这些结果表明了该方法在多重病原体检测中的潜力。

图2. PER，PS-dots，dna-lp-mb和LP-MBs@PER-PS-dots的表征。

基于人工智能的数字读出算法

为了准确分类和计数LP-MBs@PER-PS-dots，开发了一种基于AI的算法。该算法通过颜色差异、阈值处理和形态特征识别来提高准确性。与ImageJ和人工计数方法比较，AI算法表现出强的一致性，验证了其可行性。ImageJ的同质处理性质导致其与AI算法和人工计数的差异较大。该方法实现了单一和多重病原体检测能力，并建立了DNA浓度与LP-MBs@PER-PS-dots计数的关系曲线。

图3. 基于人工智能的图像处理算法的精度测试。

该数字分析方法通过优化DNA-LP-MB和PER-PS-dots的比例和杂交时间，实现了高效的病原体检测。该方法利用CbAgo酶对DNA进行特异性切割，并通过荧光编码实现信号放大。检测范围从10¹到10⁷ CFU/mL，检出限分别为6 CFU/mL（鼠伤寒沙门氏菌）、2 CFU/mL（单核增生乳杆菌）和4 CFU/mL（金黄色葡萄球菌）。该方法显示出高灵敏度和特异性，适用于多重病原体检测。

图4. 单致病菌数字检测方法

三种病原菌复合检测的数字分析方法

该数字检测方法利用CbAgo的精确切割特性，实现了三种致病菌（鼠伤寒沙门氏菌、单核增生乳杆菌和金黄色葡萄球菌）的多重检测。该方法通过特异性杂交反应保持灵敏度，检测范围为10¹至10⁷ CFU/mL。非靶菌回收率在90~110%之间，表明该方法在复杂样品中具有良好的效果。这些结果突出了该数字分析作为同时检测多种致病菌的强大方法的潜力，对食品安全和医疗保健具有重要意义。

图5. 三种病原菌复合检测的数字分析方法。

分析实际样品

该数字分析方法在30个水产食品和15个临床样本中检测了三种致病菌，结果与qPCR保持良好的一致性。数字法在低浓度样本中表现更好，检测到更多阳性样本。该方法不需要DNA扩增，检测时间短（1.5小时），适合多路检测。与传统ddPCR相比，它避免了背景干扰，提高了信噪比，但依赖于荧光显微镜，需要进一步改进以实现便携化和高通量检测。

图6. 用于检测真实样品中三种病原体的数字分析。

3. 总结

本研究设计了一种基于超亮引物交换反应介导的荧光聚苯乙烯点的多路和无扩增数字检测方法，用于检测三种致病菌。这种方法利用PER链作为信号放大策略，显著提高了PS-dots与LP-MB表面耦合的DNA结合位点，使得不同尺寸和颜色的LP-MBs@PER-PS-dots探针成为理想的数字读出探针。CbAgo的精确切割反应确保了目标序列被精确切割并与PER-PS-dots杂交，从而实现了对单个细菌信号的精确监测。为了进一步推进这一技术，他们计划重点开发便携式高通量荧光成像设备，以将应用场景从实验室研究扩展到护理点检测。同时，他们也考虑与光学成像和人工智能进行集成，利用智能手机的高清摄像头等技术来提高现实世界中的应用效率。此外，他们还希望探索有效稳定的DNA设计单链序列自主合成的可编程方法，以进一步提高DNA预扩增效率。他们相信，基于PER的荧光信号预扩增技术在病原菌数字化检测中具有广阔的应用前景。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.156440