创新多重qPCR技术：快速检测蓝藻毒素，守护饮用水安全

研究背景：

近年来，全球蓝藻水华（cyanoHABs）引发的生态与健康风险持续加剧。微囊藻毒素（MCs）作为蓝藻产生的强效肝毒素，因其热稳定性和水溶性，极易通过饮用水和娱乐用水威胁人类健康。传统检测方法如ELISA和LC-MS/MS虽能定量毒素，但存在成本高、耗时长（通常需24-48小时）且无法区分产毒与非产毒菌株的局限性。随着分子生物学技术的发展，基于基因检测的定量PCR（qPCR）逐渐成为研究热点，其通过靶向微囊藻毒素合成基因（如mcyE）实现产毒菌株的特异性识别。然而，现有方法多局限于单一基因检测，且DNA提取流程复杂，难以满足实时监测需求。本研究通过整合多重qPCR与快速DNA提取技术，首次实现了产毒基因的高通量、低成本快速筛查，为蓝藻毒素的早期预警提供了创新解决方案。

技术路线：

为了提高监测效率，研究人员开发了一种创新的多重定量聚合酶链式反应（multiplex qPCR）方法，用于快速检测产生微囊藻毒素的基因。该方法采用了两种不同的DNA提取方法：RapidDNA和ClassicDNA。

具体步骤如下：

1、样本采集：从九个水库中采集水样，包括表面样品、综合样品、近取水口样品和取水口样品，确保样本的代表性和全面性。

2、DNA提取：

RapidDNA：通过高速离心和珠磨法（bead beating）提取DNA，无需传统净化步骤，简化了操作流程。

ClassicDNA：采用经典的过滤、沉淀、洗涤和纯化步骤，确保DNA的高纯度和完整性。

3、多重qPCR分析：

针对微囊藻毒素合成基因（如mcyE）以及其他常见毒素基因（如anaC、sxtA、cyrA），设计特异性引物和探针，进行多重qPCR反应，实现同时检测和量化多个目标基因。

图1 RapidDNA和ClassicDNA方法的工作流程对比

4、结果验证：结合显微镜细胞计数、ELISA和LC-MS/MS等传统方法，验证qPCR结果的准确性和可靠性。

图2 通过 RapidDNA（红色）和 ClassicDNA（蓝色）qPCR 方法检测到的四个水库中 mcyE 基因浓度的时间动态：犹他湖（a）、迪尔克里克水库（b）、回声水库（c）和斯科菲尔德水库（d）。同一天的多个圆圈代表同时收集的各种类型（表面、复合、近进水口、进水口样本）。灰色虚线表示使用 LC-MS/MS 观察到蓝藻水华（cyanoHAB）且检测到的微囊藻毒素（MC）高于或等于 0.3 µg/L 的第一个日期。堆积柱状图显示了 RapidDNA（e）和 ClassicDNA（f）qPCR 方法的真阳性、假阴性、真阴性和假阳性病例的百分比。

构建高效、灵敏且实用的检测体系：

快速高效：RapidDNA方法省去了复杂的DNA纯化步骤，显著缩短了检测时间，适合资源有限的现场监测。

高灵敏度：ClassicDNA方法在低细胞密度条件下仍能有效检测目标基因，适用于早期预警。

多重检测：通过设计特异性引物和探针，实现了对多种毒素基因的同时检测，提高了检测效率和覆盖面。

数据关联性强：通过线性回归和ATS/Tobit回归模型，建立了基因浓度与毒素水平之间的定量关系，为预测和管理提供了科学依据。

结论：

创新的多重qPCR方法结合RapidDNA和ClassicDNA提取技术，为蓝藻水华及其毒素的监测提供了快速、可靠且经济高效的解决方案。这种方法不仅能够及时预警潜在的健康风险，还能为水资源管理和环境保护提供有力支持。未来，随着更多地区的应用和优化，这一技术有望在全球范围内推广，为保障公众健康和生态安全做出更大贡献。

文章来源：

https://doi.org/10.1016/j.watres.2025.123322