荧光探针技术助力食品安全检测：新型分支连接子提升 RNA 检测灵敏度

研究背景：

实时定量聚合酶链式反应（qPCR）是同时放大和检测基因转录本和基因组的 “金标准” 方法。传统 qPCR 通过插入染料如溴化乙锭或 SYBR Green 来实时跟踪 DNA 扩增，但易产生假阳性，且与多数多重检测策略不兼容。荧光探针的出现解决了这一问题，其中 TaqMan 探针因操作简便、可靠性高而被广泛应用。然而，其性能受荧光团和猝灭基团设计、连接方式等因素影响。如今，麦吉尔大学研究团队在这一领域取得重大进展，为食品安全检测中的病毒 RNA 检测等带来新希望。

技术路线：

研究团队设计了多种荧光探针，包括以甘油为基础的分支 “X” 型连接子探针（E-P3）和糖修饰的 araA 连接子探针（E-P2）等。他们以 SARS-CoV-2 E 基因为模型系统，利用一步法 RT-qPCR 酶混合物将 RNA 模板转换为 cDNA 并扩增，通过 qPCR 技术检测荧光信号变化，评估不同探针的性能。同时，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、热变性分析、荧光偏振等方法探究探针与模板的相互作用及探针被 Taq 聚合酶切割情况。

荧光探针结构示意图 ：从图中清晰看到 E-P3 探针的甘油 “X” 型连接子位于探针内部，连接荧光团和猝灭基团，且探针 3’ 端被 C3-OH 基团封闭，防止其作为引物被 Taq 聚合酶延伸。这种独特的结构设计，使探针在结合到 PCR 产物上时，能更好地发挥信号放大作用，提高检测灵敏度。

RT-qPCR 检测结果对比图 ：通过对比不同探针在检测 SARS-CoV-2 RNA 时的 Ct 值、信号强度及信噪比等数据，发现 E-P3 探针的 Ct 值最低，初始背景荧光低，最大荧光信号高，信噪比最佳，直观体现了其卓越的检测性能，为食品安全检测中痕量病毒 RNA 的精准检测提供了有力证据。

创新点

• 新型连接子设计 ：E-P3 探针采用的甘油 “X” 型连接子，避免了核苷酸碱基共轭带来的序列限制，具有更高的灵活性和模块化特点，可兼容多种猝灭基团，实现多重检测应用。

• 灵敏度提升 ：E-P3 探针展现出卓越的灵敏度，检测极限接近单分子水平，能检测到每反应约 4 个 RNA 拷贝，相较于传统的 3’ 端猝灭探针及内部阿拉伯糖基连接子策略的探针，检测能力大幅提升。

• 多重检测能力 ：基于 “X” 型连接子的探针成功应用于四色多重检测实验，可在一个反应中区分 SARS-CoV-2、甲型流感和乙型流感病毒的 RNA 基因组，为同时检测多种食品安全相关病毒提供了可能。

结论：

总之，这项研究为食品安全检测领域带来了更高效、灵敏的 RNA 检测技术，未来有望拓展至更多病原体检测，助力保障全球食品安全。

文章来源：

https://doi.org/10.1093/nar/gkaf141