解锁新技能！双功能纳米抗体助力SEA检测

免疫分析是一种基于抗体和抗原特异性结合的诊断工具，在医学诊断、食品安全和环境监测等领域广泛应用。然而，传统免疫分析方法如酶联免疫吸附测定（ELISA）存在一些局限性：一是需要繁琐的两步孵育过程，导致检测时间长、试剂用量大；二是需要使用高腐蚀性的硫酸作为终止缓冲液，存在安全隐患；三是在复杂环境中单一的比色响应可能导致分析结果不准确和灵敏度不足。为了克服这些挑战，研究者们开发了多种双模式免疫分析方法，如比色-荧光模式、比色-电致发光模式和比色-温度模式等，这些方法通过两种信号输出提高了分析性能和准确性。但常用的荧光物质如罗丹明B、量子点和亚甲基蓝等可能对环境和人体造成长期伤害，因此寻求安全环保的第二信号源变得十分迫切。

自然界的许多化合物具有自发荧光特性，且来源广泛、成本低廉、生物相容性好、可降解，对环境和人体无害，是理想的第二信号源候选者。在免疫分析中，抗体作为核心识别元件决定了方法的特异性和灵敏度。纳米抗体是一种从重链抗体中提取的抗体片段，具有体积小、稳定性高、能识别隐蔽表位和成本效益高等优点，可替代传统抗体作为更优的识别元件。通过基因工程，纳米抗体可与其他功能材料融合形成多功能蛋白，具备多种功能如识别、催化、追踪和偶联等，为免疫分析提供了便捷快速的途径。

葡萄球菌肠毒素（SEs）是金黄色葡萄球菌（S. aureus）合成的强效胃肠道外毒素，其中SEA是全球葡萄球菌性食物中毒的最常见原因。由于其极高的稳定性，传统的热处理等灭菌技术对SEA的解毒或清除效果不佳。此外，传统抗体因含有Fc区域，会与金黄色葡萄球菌的蛋白SpA非特异性结合，导致在检测SEA时出现非特异性识别和假阳性结果。因此，迫切需要一种有效且特异性强的SEA检测方法，以减少对人类健康的危害。

方案1。(A) NFPs优化示意图，(B)特异性纳米体筛选及双功能蛋白构建示意图，(C) SEA检测双模免疫分析法示意图。

研究内容

图1. 最优NFP的选择。

NFPs的筛选：选择了三种 NFPs（奎宁、姜黄素和核黄素）进行优化，以产生第二信号来相互验证分析结果。通过测量它们与显色底物混合后的发射光谱，并计算荧光猝灭率，发现奎宁的猝灭效果最佳，因此被选为双模式免疫分析的荧光信号源。

图2. 抗SEA特异性纳米体的筛选与表征分析。

特异性纳米抗体的筛选：利用噬菌体展示技术和生物淘选，经过5轮免疫后，骆驼血清效价达到256000，证明SEA免疫刺激了骆驼体内大量产生抗SEA抗体。通过分子生物学技术将VHH与pMECS载体连接并电穿孔转入TG1，构建了针对SEA的特异性噬菌体展示库。经过三轮生物淘选，获得特异性阳性克隆，并通过间接ELISA对其热稳定性和特异性进行评估，结果显示纳米抗体在高温处理后仍能保持80%的结合活性，且仅对SEA产生信号响应，具有优异的特异性。

图3. 三明治免疫分析中最佳检测和捕获纳米体的选择。

双功能蛋白的构建与表征：将检测纳米抗体SEA33与催化酶HRP融合成双功能蛋白SEA33-vHRP。通过Phyre2预测其结构，显示SEA33和HRP通过连接肽连接，分布于蛋白两侧，可独立行使其功能。经免疫荧光分析和SDS-PAGE分析等验证，SEA33-vHRP具有良好的分泌表达、纯化效果以及催化活性和识别特异性。

图4. 双功能蛋白SEA33-vHRP的制备。

双模式免疫分析的建立与性能评估：以SEA18为捕获纳米抗体，SEA33-vHRP为检测纳米抗体，建立了双模式免疫分析方法。通过优化相关参数，确定了最佳条件。在该条件下，对不同浓度的SEA进行分析，发现比色模式下吸光度值随SEA浓度增加而增加，荧光模式下因oxTMB的猝灭作用荧光强度随SEA浓度增加而降低。两种模式的标准曲线均具有良好的拟合度，比色模式和荧光模式检测SEA的LOD分别为0.09ng/mL和0.40ng/mL，比传统基于单克隆抗体的ELISA低约16倍，且通过双模式检测可相互验证测试结果，避免复杂检测环境中分析不稳定。

特异性与稳定性评估：该方法对SEA有明显响应，而对其他干扰肠毒素无响应，且不受金黄色葡萄球菌的干扰，具有良好的特异性和抗干扰能力。双模式免疫分析的稳定性研究表明，在3周的储存期内，其催化活性保持在90%以上。

图5. 所提出的双模免疫分析法的分析性能。

该研究意义重大，首次使用低成本、环保的大豆蛋白为主要原料，避免有毒交联剂，成功制备出具有优异机械性能的三维多孔SPI/CA/SA冷冻凝胶支架。不过，要实现SPI/CA/SA支架大规模工业应用，还需克服可扩展性、生产效率、精确控制支架孔隙率和机械性能、提高细胞分化率等挑战。但随着不断优化和融入大规模生产，该支架有望推动高效、经济的人造肉生产。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.142362