像养细菌一样 “养” 核酸！新技术实现裸眼核酸检测

你能想象吗？以后检测核酸就像培养细菌一样简单，用肉眼就能直接看到结果！近日，一项发表于ACS Sensors的研究带来了这样令人惊喜的突破，开发出一种数字核酸平板培养方法，实现无标记、超简单的裸眼核酸分析。

全球传染病负担日益加重，核酸定量分析至关重要。目前常用的数字聚合酶链反应（dPCR）虽能精准定量核酸，但设备昂贵、操作复杂，且依赖荧光读数，裸眼视觉计数困难。受细菌平板培养技术的启发，研究团队开发出了这项全新的核酸检测技术。

这种 “核酸平板培养” 技术的原理十分巧妙。研究人员以聚丙烯酰胺（PAM）水凝胶为扩增基质，进行纳米限域数字环介导等温扩增（dLAMP）。在扩增过程中，会产生大量副产物焦磷酸根离子，它与镁离子反应，生成焦磷酸镁颗粒（MPPs）。水凝胶的纳米限域效应，就像给反应搭建了一个个 “小格子间”，不仅能显著加速目标核酸的扩增，还能促进 MPPs 的生长，同时限制它们的扩散和聚集。最终，这些 MPPs 被水凝胶原位捕获，形成白色的 “菌落” 斑点。由于 MPPs 具有增强的光散射特性，这些斑点在背景下十分明显，用肉眼就能清晰看到，每一个斑点都代表着一个原始的单目标核酸，数一下斑点数量，就能实现对目标核酸的绝对定量，是不是很神奇？（如图 1所示 ）

图1. 聚丙烯酰胺（PAM）水凝胶中核酸平板培养过程。(a) 将含有靶核酸、环介导等温扩增（LAMP）试剂和 PAM 单体的混合物加载到载玻片上的反应小室中，然后在 65°C 下孵育 30 分钟，启动凝胶化和 LAMP 反应。原位形成的水凝胶的纳米多孔结构和絮凝作用能够限制核酸扩增以及焦磷酸镁Mg₂P₂O₇沉淀的生长，最终产生分散良好的单个颗粒，这些颗粒可直接用肉眼计数，或者通过基于智能手机的机器学习算法自动计数，以实现绝对定量分析。(b) 以大肠杆菌 malB 基因为靶标，进行纳米限域 LAMP 反应后反应小室的照片。由于焦磷酸镁Mg₂P₂O₇颗粒具有明显的光散射特性，其分散良好，可清晰地观察到白色斑点。左图：10 毫米 ×10 毫米；右图：15 毫米 ×80 毫米。

为了验证这种方法的可靠性，研究人员做了一系列实验。他们用 EvaGreen 作为染色剂记录荧光图像，发现荧光斑点的位置和数量与肉眼观察到的白色斑点高度吻合，证实了每个白色斑点确实代表一个原始单目标核酸。加入焦磷酸酶的对照实验表明，白色斑点的确由焦磷酸镁构成。而且，研究发现水凝胶中 MPPs 的形成速度比溶液中快得多，这得益于水凝胶出色的纳米限域能力和离子絮凝作用，图 2 对比了传统液滴数字 LAMP和水凝胶中 MPPs 的生成情况，水凝胶中的 MPPs 分散良好，而液滴中的容易聚集。

图2. (a) 液滴数字环介导等温扩增（ddLAMP）反应结果的荧光图像（上图）和明场图像（下图）。红色矩形框指示阳性液滴中焦磷酸镁颗粒（MPPs）的存在。(b, c) LAMP 反应后在水溶液（b）和聚丙烯酰胺（PAM）水凝胶（c）中生成的 MPPs 的扫描电子显微镜（SEM）图像。(c) 中的红色框标注了水凝胶中 MPPs 的存在。(d) 单个 MPP 的放大图像及其相应的 X 射线能量色散光谱（EDS）映射结果。(e, f) LAMP 反应后，在不同样品位置和不同储存时间下，PAM 水凝胶（e）和水溶液（f）的透光率。(g) 在 65°C 进行 LAMP 孵育过程中，水溶液和 PAM 水凝胶在 400nm 处的消光动态变化。

为了进一步提高分析效率，研究团队还开发了基于机器学习的自动计数系统。通过训练模型，它能精准识别图像中的斑点，排除杂质和气泡干扰，实现核酸的绝对定量，且自动计数结果与手动计数一样准确。在实际样本分析中，该方法表现出色，能直接对临床血液和新鲜食物中的耐药菌进行计数，30 分钟内就能报告定量和耐药信息，在检测速度和准确性上远超传统方法。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acssensors.3c02807