拉曼光谱与MTT：快速检测细菌耐药性的新策略

AMR已成为全球健康的重大威胁，2019年与之相关的死亡人数达495万，其中197万直接由耐药感染导致。在美国，AMR使医疗成本剧增，生产力严重受损，且耐药感染治疗困难，失败率高。在败血症等危及生命的病症中，快速治疗至关重要。然而，传统的抗生素敏感性测试（AST），因其依赖检测细菌生长及抑制情况，通常需要1 - 2天才能完成，致使在等待结果时往往采用经验性治疗方案，且结果常因延迟而未被使用，进而延长患者住院时间，增加死亡率。MTT实验是一种常用的检测细胞活性和细胞毒性的方法。MTT能被活细菌细胞内的酶还原成紫色不溶性甲臜，甲臜的生成量与细胞代谢活性相关，可反映细菌对抗菌药物的反应。常规的分光光度法在检测MTT还原反应时，易受背景物质干扰，导致检测结果准确性欠佳。为减少干扰，常采用有机溶剂对甲臜进行提纯，但这一过程存在诸多弊端。一方面，有机溶剂可能会破坏甲臜的稳定性，使甲臜的化学结构发生改变，进而影响其在检测中的吸光特性；另一方面，提纯操作较为繁琐，不仅增加了实验的复杂性和时间成本，而且在多次转移、分离过程中，容易造成甲臜的损失，同样会干扰最终检测结果的精准度。拉曼光谱技术则为解决这些问题带来了新的思路。拉曼光谱是一种基于非弹性光散射的无标记、非侵入性技术，它能提供物质的特征光谱，就像物质的“指纹”一样，可用于特异性识别（图1）。在MTT实验中引入拉曼光谱技术，能够直接对甲臜进行检测，无需繁琐的提纯步骤，避免了有机溶剂的干扰，大大提高了检测的准确性和便捷性。此外，拉曼光谱技术具有高灵敏度和特异性，能够检测到低浓度样本中的甲臜信号，从而提供更可靠的检测结果。

基于此背景，Vladimir Mushenkov等人将MTT实验与共振拉曼光谱（RRS）技术相结合，开发了一种快速、准确的AST方法。其工作流程和原理可以概述为：细菌在含有不同浓度梯度的抗生素的培养基中孵育30 min后，加入MTT溶液再孵育20 min，然后使用拉曼光谱仪对样本进行检测（约30 min）。通过分析拉曼光谱中甲臜特征峰的强度变化（其光谱中特定峰的强度和位移与甲臜浓度相关）：相对对照组，拉曼光谱强度下降50%对应的抗生素使用量即为研究的MIC值，全流程耗费1.5 h。如图2所示，对左氧氟沙星敏感和耐药的大肠杆菌菌株在与抗生素孵育30 min后，拉曼光谱强度差异趋于稳定，且尽管抗生素并未能全部杀死敏感菌，但是敏感菌株受抗生素影响，代谢活性被抑制得更明显，导致MTT还原为甲臜的量减少。以不同浓度的卡那霉素对大肠杆菌进行测试，本方法得出的MIC值为2.5 μg/mL，与E-test测试结果一致。进一步，作者各利用针对左氧氟沙星敏感和耐药的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌对方法的实用性进行了评价，得到的结果与E-test法结果基本一致（表1）。

总的来说，本研究成功开发了一种基于RRS和MTT实验的快速AST技术，该方法能够在1.5 h内完成MIC的测定，显著提高了检测效率。此方法在针对左氧氟沙星和卡那霉素的耐药和敏感大肠杆菌及肺炎克雷伯菌菌株上进行了验证，结果也与传统 Etest 方法基本一致。然而，研究仅针对部分大肠杆菌和肺炎克雷伯菌菌株以及特定的几种抗生素进行研究，在目标菌株和抗生素种类上研究范围较窄，未展示该方法在其他菌株，如革兰氏阳性菌上的应用效果。此外，目前研究样本数量有限，限制了研究结果的普遍适用性和统计学意义，还需要大规模研究进一步验证 。

图1  MTT（A）、甲臜（B）和经过MTT处理的大肠杆菌（C）的拉曼光谱。

图2  （A）左氧氟沙星（13μg/ml）作用下敏感型和耐药型大肠杆菌的时间依赖性拉曼光谱强度曲线。（B）卡那霉素敏感的大肠杆菌菌株经不同浓度卡那霉素处理后的拉曼光谱。

表1  本方法和和E-test法测定的左氧氟沙星的MIC的比较

原文链接：https://doi.org/10.1098/rsob.240258