革新细菌鉴别：ALM-SERS 系统实现耐药菌快速分型

研究背景

抗生素的滥用正催生越来越多的 “超级细菌”，世界卫生组织（WHO）早在 2014 年就将耐药菌列为全球健康的重大威胁。临床微生物检测的核心挑战在于快速准确区分细菌种类及耐药性，这直接关系到抗生素的合理使用。表面增强拉曼光谱（SERS）因其无标记、分子指纹特异性的优势，成为新兴检测技术。细菌分泌的代谢物（如嘌呤衍生物）可通过 SERS 光谱差异实现分型。然而，现有技术面临两大瓶颈：1、近缘菌株代谢物差异微弱：同菌种不同耐药株分泌的嘌呤衍生物组成相似，仅比例不同，导致单一光谱难以区分；2、分子竞争吸附干扰：高亲和力分子（如腺嘌呤）会占据 SERS 基板表面，掩盖低亲和力分子（如胞嘧啶）的信号，造成光谱失真。

如何突破分子竞争限制，获取更全面的光谱信息？台湾大学团队将目光投向了微流控技术，通过集成微流控与 SERS，开发出 ALM-SERS 系统，为上述难题提供了创新解决方案。

研究原理

（一）气液微流控：精准操控微液滴的 “分子工厂”

ALM-SERS 系统的核心是八微孔阵列的 PDMS 微流控芯片（图1），每个微孔通过优化几何参数（60° 夹角、2mm 直径等）实现微液滴的精准定位，体积损失仅 5%。通过压力泵系统调控液滴移动：

- 基线流速（-4 μL /min）：使液滴稳定停留于微孔，确保分子充分吸附；

- 引导流速（80±30 μL/min）：推动液滴依次通过 8 个微孔，形成 “顺序吸附” 路径。

图1 ALM-SERS系统示意图

这种设计使含有复杂分子混合物的细菌上清液，在流经每个微孔时，因分子亲和力差异发生分层吸附：高亲和力分子优先吸附于上游微孔（如微孔 #1-3），低亲和力分子则在下游微孔（如微孔 #4-8）逐渐显现信号。

（二）SERS 基板：捕捉分子指纹的 “纳米天线”

研究采用银纳米颗粒修饰的玻璃基板，通过电子束蒸发技术控制银层厚度为 7 nm，确保均匀的电磁场增强效应。SERS 的双重增强机制在此发挥关键作用：

- 电磁增强：银纳米结构的局域表面等离子体共振放大拉曼信号；

- 化学增强：分子与银表面的电荷转移进一步提升特异性吸附分子的信号强度。

通过微流控与 SERS 的协同，系统实现了 “空间 - 亲和力” 维度的分子分解：每个微孔对应特定亲和力范围的分子，8 组光谱共同构建了更完整的代谢物指纹图谱。

研究亮点

（一）首创 “顺序分子吸附” 策略，破解信号干扰难题

传统 SERS 检测中，高亲和力分子（如腺嘌呤）会完全占据基板表面，导致低亲和力分子（如胞嘧啶）信号被掩盖。ALM-SERS 通过液滴顺序移动，使不同亲和力分子在不同微孔中分步吸附（图2）：

- 上游微孔（#1-3）：富集高亲和力分子（如腺嘌呤、次黄嘌呤），其特征峰强度在微孔 #1 达到峰值，随后迅速衰减；

- 下游微孔（#4-8）：低亲和力分子（如尿嘧啶、胞嘧啶）逐渐摆脱竞争，信号得以显现。

图2 不同时间点，微孔#1-#8封装液体的荧光图像

这一策略通过空间分离替代传统的化学分离，无需额外试剂即可实现分子混合物的原位解析，显著提升了光谱信息的完整性（图 3A-F）。

图3 微孔 #1 至 #8 的 SERS 光谱及对应的 SERS 特征峰衰减曲线

（二）八微孔光谱集成，突破近缘菌株鉴别极限

对于传统方法难以区分的同菌种耐药株（如大肠杆菌 DH5α 野生型与氨苄青霉素耐药株），单一微孔光谱（如 #1）显示相似特征，而八微孔光谱组合通过主成分分析（PCA）可清晰区分：

野生型与耐药株的光谱在 PCA 空间中完全分离（图 4B），分类准确率从单一光谱的 93% 提升至 100%（图 4D）；

临床分离的庆大霉素耐药 / 敏感株实验中，八微孔光谱组合的 PCA 分析显著优于单一光谱（图 4E）。

图4 仅适用微孔#1和使用微孔#1-#8的SERS光谱组合的六种细菌物种的PCA图

（三）微流控 - SERS - 机器学习的全链条创新

系统整合了三大技术模块：

- 微流控硬件：优化微孔几何参数，实现液滴体积与位置的精准控制（图 2）；

- 动态光谱采集：通过 XY 轴电机驱动平台，同步采集液滴在 8 个微孔中的实时光谱（图 1C）；

- 机器学习分析：结合支持向量机（SVM），对多维度光谱数据进行模式识别，显著提升分类精度。

实验效果

（一）分子水平：亲和力排序与竞争吸附验证

研究首先通过单一分子实验建立嘌呤衍生物亲和力谱：

- 高亲和力分子：腺嘌呤（10⁻⁵ M）在微孔 #1 的信号强度为 #8 的 125 倍，衰减曲线呈指数下降；

- 低亲和力分子：胞嘧啶（10⁻⁴ M）在所有微孔中信号差异小于 10%。

混合分子实验（腺嘌呤 / 胞嘧啶，10:1 至 1:10 比例）显示，下游微孔中低亲和力分子的信号随高亲和力分子浓度降低而增强，证实了竞争吸附的动态调控（图 5C）。

图5 竞争性分子吸附分析

（二）细菌鉴别：从标准菌株到临床样本

- 标准菌株测试：

六种细菌（包括革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌不同株）的八微孔光谱组合，通过 PCA 可完全区分，即使是遗传背景高度相似的 DH5α 野生型与耐药株也能清晰分群（图 4B）。

- 临床样本验证：

从败血症患者血液中分离的 6 株大肠杆菌（3 株庆大霉素敏感，3 株耐药），单一微孔光谱无法有效区分耐药性，而八微孔光谱组合的 SVM 分类准确率达 100%（图 4E）。

未来展望

ALM-SERS系统可在30 分钟内完成细菌代谢物的分泌与检测，较传统培养法提速 90% 以上。未来结合高通量微流控阵列（如并行五通道设计），有望实现多菌种同步检测，为血流感染的床边诊断提供即时数据支持。除微生物检测外，该技术在以下领域具有广阔应用前景：1、药物开发：解析药物 - 靶点分子的结合动力学，优化药物设计；2、食品安全：检测食品中痕量污染物（如农药残留、毒素）的多重分子指纹；3、环境监测：追踪水体/土壤中复杂污染物的组分变化，预警生态风险。

当前系统仍依赖实验室级拉曼显微镜，未来可集成便携式拉曼光谱仪与微流控芯片，开发手持型检测设备。结合深度学习算法优化光谱特征提取，有望进一步提升现场检测的准确性与便捷性。

ALM-SERS 系统的诞生，标志着微生物检测从 “单一光谱识别” 迈向 “多维分子解析” 的新范式。通过微流控与 SERS 的深度融合，这项技术不仅攻克了耐药菌鉴别这一临床难题，更开创了复杂分子混合物分析的通用方法论。正如研究团队在结论中所言，其潜力远超微生物学领域，将为生命科学、医学乃至环境科学带来革命性的检测工具。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117576