双模式检测技术：一锅法RPA-CRISPR/Cas12a结合电化学试纸条，实现沙门氏菌超灵敏精准检测

研究背景

沙门氏菌是全球范围内最严重的食源性致病菌之一，每年导致超过6亿例食物中毒病例和42万例死亡。传统检测方法（如PCR、培养法）依赖专业实验室和昂贵设备，耗时长且难以现场应用。尽管CRISPR技术具有高特异性，但其灵敏度仍需依赖核酸扩增，而现有RPA-CRISPR联用方案多需分步操作，易因开盖引发污染风险。总而言之，目前的检测技术具有灵敏度不足、操作复杂、难以定量、污染风险等诸多痛点。基于此背景，合肥工业大学相关团队开发了一款名为 OPRCC-eLFS 的新型双模式检测平台，将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a技术整合于“一锅式”反应中，并创新性地结合电化学侧流层析试纸条（eLFS），实现了沙门氏菌的超灵敏、快速、精准检测。

研究原理

技术核心是RPA-CRISPR/Cas12a与eLFS的完美融合，主要原理分为两个部分，一是一锅式反应设计，二是双模式信号的输出。

1. 一锅反应设计（图1）：

- RPA扩增：在恒温（41°C）下快速扩增沙门氏菌靶基因； 

- CRISPR/Cas12a激活：扩增产物激活Cas12a的随机反式切割活性，特异性切割双标记探针（Bio-ssDNA-FITC）。 

- 关键创新：通过优化引物、crRNA和Cas12a浓度，实现RPA与CRISPR反应的动态平衡，避免扩增产物被非特异性切割。 

图1 用于检测沙门氏菌的OPRCC-eLFS装置示意图

2. 双模式信号输出（图2-3）： 

- 颜色定性：金纳米颗粒（AuNPs）标记的探针被切割后，试纸条T线颜色变浅；

- 电化学定量：AuNPs催化铁氰化钾（Fe³⁺）与氨硼烷（AB）的还原反应，通过电流变化精准定量。

图2 Fe³⁺/AuNPs/AB氧化还原系统的可行性证明

图3 OPRCC-eLFS的可行性分析

研究亮点

1. 一锅法集成： 

- RPA扩增与CRISPR切割在单管内完成，无需分步操作，检测时间缩短至90分钟（传统方法需数小时）。 

- 避免开盖污染，适合现场快速筛查。 

2. 双模式信号互补： 

- 视觉筛查（LFS模式）：检测限384 CFU/mL，肉眼可判读； 

- 电化学定量（eLFS模式）：灵敏度高达3.84 CFU/mL，线性范围跨越7个数量级。 

3. 抗干扰与高特异性： 

- 双重识别（RPA扩增+CRISPR切割）确保仅靶基因触发信号； 

- 对常见食源性致病菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）无交叉反应（图4D-E）。 

图4 检测性能与特异性验证

4. 稳定与便携性： 

- 试纸条30天内信号稳定性偏差<10%，适合长期储存； 

- 配套便携电化学检测仪，可现场输出定量结果。 

实际检验结果

1. 灵敏度与线性（图4）： 

- 电化学模式检测限低至3.84 CFU/mL（比传统LFS高100倍）； 

- 在牛奶、橙汁、鸡蛋等复杂基质中均表现稳定，回收率>90%。 

2. 实际样本测试（图5）： 

- 加标食品样本（如牛奶、三文鱼）中，检测结果与商用qPCR高度一致（R²>0.99）。

图5 真实食品样本的检测应用

3. 抗污染能力： 

- 一锅法设计使气溶胶污染风险降低90%以上。 

总结与展望

此设备在食品安全监控（如乳制品、肉类、生鲜等产业链的快速抽检）、临床诊断（扩展至其他病原体如新冠病毒、结核杆菌的即时检测）、环境监测（水体、土壤中致病菌的高通量检测）等领域有诸多的应用潜力。同时可以结合物联网实现数据云端传输与实时预警；并且尝试开发多联检试纸条，同步检测多种病原体。

OPRCC-eLFS的诞生标志着分子诊断技术的又一重大突破！它不仅解决了传统方法的灵敏度与操作繁琐问题，更通过双模式输出，为食品安全与公共卫生安全筑起一道智能防线。未来，随着便携设备的普及，这项技术有望成为家庭、农场、乃至偏远地区的“健康守护神”。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117529