微流控黑科技：3小时锁定天然抗超级细菌分子

抗菌药物耐药性（AMR）已成为全球健康重大威胁，截至 2019 年，其感染直接导致约 127 万人死亡，预计 2050 年每年死亡人数将达 1000 万。当前新型抗生素开发滞后，耐药菌数量激增，亟需高效筛选技术挖掘新型抗菌分子。植物源天然产物（如黄酮、萜类）因结构多样性成为重要候选来源，但低丰度活性成分的筛选受限于传统方法的高样本消耗（需过夜培养、操作繁琐）。微流控技术虽被视为潜在解决方案，但其在高通量筛选中仍面临稳定性和用户友好性挑战。应对此挑战，上海交通大学沈峰团队开发了纳升矩阵滑动微流控芯片（nm-SlipChip），通过构建纳升液滴筛选矩阵（单滴体积 38 nL），可同时进行100 种药物 - 细菌组合的并行分析。与传统 96 孔板相比，该技术样本消耗量降低 5000 倍，检测时间从 18 小时缩短至 3 小时，显著提升了筛选效率。

研究以全缘紫珠（Callicarpa integerrima）为材料，通过 nm-SlipChip 介导的生物活性导向分离，从其提取物中筛选出 20 种单体化合物，分析流程见图1。其中，化合物 1 和化合物 2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）表现出显著抑制活性（图2），二者均为新型 clerodane 二萜类化合物，结构通过核磁共振（NMR）、高分辨质谱、电子圆二色谱（ECD）等确证。进一步机制研究表明，化合物 2 通过破坏细菌细胞膜完整性和生物膜成熟发挥抗菌作用：分子对接显示其与生物膜调控蛋白 SarA 及膜色素合成酶 CrtM 结合，荧光探针实验（PI 染色、SYTOX Green/ Hoechst 33342 多色荧光标记）证实其导致细胞膜通透性增加，激光共聚焦显微镜观察到生物膜结构显著瓦解（图3）。

总的来说，nm-SlipChip 为天然产物中抗菌成分的快速筛选提供了高效、低耗的新工具，尤其适用于低丰度活性分子的挖掘，为应对 AMR 提供了新策略。该技术通过简单滑动操作即可实现多组合并行分析，兼具灵活性和高通量优势，未来有望扩展至其他生物活性分子筛选及合成生物学领域。

图1  nm-SlipChip用于天然产物抗菌活性筛选的工作流程。（1-3）初级纯化。将植物材料粉碎并干燥，通过甲醇提取获得粗提物。粗提物经柱层析分离，得到多个组分。（4-6）生物活性导向分离。将柱层析得到的组分加载到 nm-SlipChip 中，快速筛选出具有抗菌活性的组分。对活性组分进一步通过高效液相色谱（HPLC）分离纯化，获得单体化合物（如 Compound 1、2、3）。再次利用 nm-SlipChip 对单体化合物进行抗菌活性筛选，确认目标活性分子。（7）生物活性表征。目标化合物的定性和定量分析。（8）结构表征。通过多种分析技术确定活性化合物的化学结构和立体构型，包括核磁共振（NMR）、高分辨质谱（HRMS）、红外光谱（IR）及电子圆二色光谱（ECD）结合量子化学计算。

图2  （A）分离得到的20种单体化合物的抗菌活性筛选；（B-C）化合物1和化合物2处理或不处理细菌细胞的代表性显微镜图像。（D）基于图B-图C的细菌定量结果，以评判化合物1和化合物2对MRSA的抑制效果。

图3  （A-B）化合物2与金黄色葡萄球菌生物膜形成相关蛋白SarA（PDB ID: 2FRH）（A）及与4,4'-二去甲基类胡萝卜素合成酶（CrtM，PDB ID: 2ZCO）的分子对接结果。SarA和CrtM都与细胞膜的完整性相关。（C）化合物2（64 μg/mL）在nm-SlipChip上对MRSA的抗菌活性测试结果。（D）基于nm-SlipChip确定化合物2的MIC值为64 μg/mL。（E）标准微量稀释法（以刃天青为指示剂）测定化合物2的MIC为64 μg/mL，验证nm-SlipChip方法定量MIC值的能力。（F）使用碘化丙啶（PI）检测化合物2处理后的MRSA细胞膜完整性。（G）多色荧光染色实验。Hoechst 33342（蓝色）：标记所有细菌（无论膜是否完整）。SYTOX（绿色）和PI（红色）：仅进入膜受损细胞。对照组以蓝色荧光为主，化合物2处理组绿色和红色荧光显著增强，与阳性对照蜂毒肽（Melittin）结果一致，进一步证实其破坏细胞膜的机制。（H）生物膜破坏实验。通过FITC和DAPI进行染色，展示了化合物2处理后的生物膜显示出明显的结构破坏，与未处理的对照组相比，生物膜中的细菌数量显著减少，表明化合物2具有显著的生物膜破坏能力。FITC：标记生物膜的外层结构或细胞表面的蛋白质，帮助观察生物膜的整体形态和完整性。DAPI：标记生物膜中细菌的细胞核，帮助观察细菌在生物膜中的分布情况。

原文链接：https://doi.org/10.1002/smtd.202402045