PMA-qPCR技术：生菜洗涤水活菌检测的创新解决方案

原创

来源：蔡伟程

2025-05-29 17:32:28

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核心提示：本文介绍开发了一种优化的PMA-qPCR方法的研究，用于检测罗马生菜洗水中的活性大肠杆菌O157:H7。通过优化PMA浓度和光照时间，实现了对活菌的高灵敏度检测，检测限低至1.3 CFU/mL，并在不同化学需氧量水平下表现出良好稳定性。但该方法在死菌数量远超活菌时准确性下降。未来需进一步优化以提升其在复杂样本中的适用性，为食品安全监测提供新思路。

在全球范围内，大肠杆菌O157:H7是导致食源性疾病的主要致病菌之一，尤其在新鲜农产品中频繁出现，尤其是生菜等绿叶蔬菜。为了确保食品安全并减少食源性疾病的发生，准确检测新鲜农产品洗水中的活性大肠杆菌O157:H7显得尤为重要。近期，马里兰大学的研究团队开发了一种优化的叠氮溴化丙锭（PMA）定量PCR（qPCR）方法，以提高在罗马生菜洗水中检测活性大肠杆菌O157:H7的能力。

研究背景

在生鲜农产品的后处理过程中，洗涤水常常成为微生物污染的温床。蔬菜表面的微生物在清洗过程中会转移到洗涤水中，如果不加以控制，这些微生物可能在洗涤水中存活甚至繁殖，从而增加食品链中的交叉污染风险。因此，洗涤水的监测对降低污染风险、确保新鲜农产品的微生物安全至关重要。

传统的培养基检测方法虽然可以检测活性大肠杆菌，但过程繁琐且耗时，难以满足快速决策的需求。相比之下，qPCR作为一种高灵敏度和特异性的分子检测工具，逐渐被应用于病原体的检测。然而，qPCR无法区分活细胞和死细胞的DNA，这一缺陷可能导致假阳性结果，进而影响食品安全的评估。

PMA-qPCR方法的创新

为了解决这一问题，研究团队引入了PMA这一核酸染料。PMA能够选择性地穿透死细胞，并在光照下与其DNA共价结合，从而阻止其在qPCR中的扩增。这种选择性抑制确保只有活细胞的DNA被扩增，从而提供更为准确的微生物污染评估。

图1 使用叠氮溴化丙锭（PMA）-定量聚合酶链式反应（qPCR）检测生菜洗涤水中活大肠杆菌O157:H7的实验流程示意图。

研究结果

在这项研究中，研究人员系统地优化了PMA的浓度和暴露时间，以确保在抑制死细胞DNA扩增的同时，不影响活细胞的完整性。PMA浓度和光照时间对检测效果影响显著。实验数据表明，10μM的PMA浓度能有效抑制死细胞DNA的扩增，同时对活菌的影响较小；10分钟的光照时间则能确保PMA充分发挥作用，且不会对活菌造成损伤。值得一提的是，该优化后的方法在不同化学需氧量（COD）水平的生菜洗涤水中都表现出良好的稳定性。无论是较高COD水平（1000mg O₂/L）模拟的低质量洗涤水，还是较低COD水平（200mg O₂/L）接近实际清洗槽条件的洗涤水，它都能准确检测出活菌，显示出对有机物干扰的强大耐受性。而且，其检测限低至1.3 CFU/mL（如图2C），对于低细菌载量的检测十分适用，能够满足食品行业严格的安全检测标准。

图2 使用叠氮溴化丙锭-定量聚合酶链式反应（PMA - qPCR）在化学需氧量（COD）为200 mg O₂/L的生菜洗涤水中检测活大肠杆菌O157:H7时，对PMA - qPCR的叠氮溴化丙锭（PMA）浓度（A）和曝光时间（B）的优化。误差线代表三次独立试验的标准差。星号表示显著差异（***，p<0.001 ；****，p<0.0001）。使用活细胞的10倍系列稀释液生成PMA - qPCR的标准曲线（C），以建立循环阈值（C_t）值与活细胞计数（log CFU/mL）之间的线性关系。误差线代表三次独立试验的标准差。

然而，研究也指出，PMA-qPCR的准确性受到活菌与死菌比例的影响。当死菌数量超过活菌10倍以上时，PMA-qPCR的准确性显著下降。这表明，在高死菌负荷的样品中，PMA-qPCR的应用可能受到限制。未来的研究需要进一步优化PMA预处理方案，或探索其他辅助技术，以提高其在复杂样品中的适用性。

图3 在化学需氧量（COD）为200 mg O₂ /L的生菜洗涤水中，使用叠氮溴化丙锭（PMA）-定量聚合酶链式反应（qPCR）检测活的大肠杆菌O157:H7，并与CHROMagar ECC平板计数法和qPCR进行比较：（A）活细胞浓度低于死细胞浓度；（B）活细胞浓度高于死细胞浓度；（C）活细胞浓度与死细胞浓度相等；（D）仅存在活细胞；（E）仅存在死细胞。误差线表示三次独立试验的标准差。星号表示差异显著（*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001）。

未来展望

本研究的结果不仅验证了优化的PMA-qPCR方法在检测活性大肠杆菌O157:H7方面的有效性，还强调了在样本中活细胞与死细胞比例的重要性。随着食品安全问题日益受到重视，未来的研究应致力于提升PMA-qPCR在处理高死细胞负荷样本时的能力，可能通过改进PMA配方、优化预处理协议以及结合其他技术来实现。

此外，探索将PMA-qPCR应用于其他病原体的检测以及在不同复杂基质中的应用，将为食品安全和环境监测提供更为全面的解决方案。通过不断优化检测策略，确保食品安全，保护公众健康将成为科研人员和食品行业共同的目标。

结论

本研究展示了优化的PMA-qPCR方法在罗马生菜洗涤水中检测活性大肠杆菌O157:H7的潜力。该方法对有机负荷的耐受性和高灵敏度使其成为新鲜农产品加工环境中低细菌负荷应用的可靠工具。这一研究为提高食品安全监测策略提供了新的思路，推动了食品安全和公共健康的保障工作。未来，随着技术的不断进步和优化，PMA-qPCR有望在更广泛的食品安全监测场景中发挥重要作用。

参考文献：

Chen Z. Enhanced Detection of Viable Escherichia coli O157: H7 in Romaine Lettuce Wash Water Using On-Filter Propidium Monoazide-Quantitative PCR[J]. Microorganisms, 2024, 13(1): 34.