抗生素耐药性（AMR）已成为全球重大挑战，每年导致超过70万人死亡，预计到2050年将增加到1000万人。随着AMR的加剧，寻找新的治疗方法以对抗急性和慢性细菌感染成为当务之急。噬菌体疗法，即利用噬菌体对抗细菌感染，因其高度针对性而受到关注。与抗生素的非选择性作用不同，噬菌体能够精准杀死细菌，对宿主微生物群的干扰最小。然而，噬菌体疗法的实施通常依赖于劳动密集型和耗时的方法，限制了其潜力。个性化噬菌体疗法需要从患者体内分离出耐药细菌菌株，并从大型噬菌体库中筛选出有效的治疗噬菌体。目前，噬菌体库的筛选主要依赖于基于培养的斑点测试，这种方法耗时且操作复杂。因此，开发一种能够快速、高通量筛选噬菌体的技术对于个性化噬菌体疗法的临床应用至关重要。

个性化噬菌体治疗开始于被认为对现有抗生素具有耐药性的分离致病菌菌株，并对大型治疗性噬菌体文库和/或预计含有噬菌体的环境样本文库进行筛选（图1a-i）。基于培养的方法，根据目标细菌的不同，需要很长的潜伏期，从一夜到几天不等（图1a-ii）。本研究构想了一种治疗性噬菌体文库，其物理格式为稳定且包罗万象的固体片剂，每个片剂包封一个噬菌体以及生物化学检测噬菌体介导的细胞裂解（图1a-iii）。检测释放的三磷酸腺苷（ATP）作为噬菌体介导的细菌裂解的代理，可以实现快速和高通量的噬菌体文库筛选（图1b）。

图1. 视觉和噬菌体表征示意图。

研究内容

噬菌体介导的细菌裂解：研究者们从噬菌体库中选取了三种噬菌体（P32、JG004和PP7），它们对铜绿假单胞菌（Pa）的裂解能力不同。通过透射电子显微镜观察了噬菌体的形态，并通过平板法观察了噬菌体在Pa菌落上形成的噬菌斑，表明这些噬菌体能够成功感染并裂解Pa。通过XTT比色法生成的细菌代谢活性变化曲线进一步表征了噬菌体介导的细菌裂解能力，结果显示P32和JG004能显著抑制细菌生长，而PP7则不能。

图2. 序列法检测噬菌体介导的ATP释放

信号-噪声比的提高和噬菌体介导细菌裂解的终点检测：为了减少背景信号，研究者们对噬菌体悬浮液进行了处理，以降低残留的ATP分子。结果表明，稀释法与繁琐的PEG纯化技术一样有效，因此研究者们采用稀释法来降低背景生物发光信号。通过将噬菌体与宿主细菌混合，在生理温度下培养，并定期取样加入ATP检测试剂，测量生物发光信号，实现了噬菌体介导裂解的终点检测。在高MOI（10）下，P32和JG004噬菌体在30分钟内即可检测到生物发光信号，而PP7噬菌体在MOI=10时需要60-120分钟才能检测到显著信号。

图3. 单罐ATP生物发光试验。

噬菌体裂解活性的一锅法检测：研究者们开发了一种一锅法检测噬菌体裂解活性的方法，将所有ATP检测试剂与噬菌体混合，然后加入细菌悬浮液，在37℃下培养，实时测量噬菌体诱导的ATP释放。结果显示，P32和JG004噬菌体在感染后30分钟内可检测到信号，峰值出现在60分钟左右。该方法不仅能够区分未感染和感染的细菌培养物，还能区分不同噬菌体的裂解活性，即使在初始噬菌体浓度较低的情况下也能有效。

图4. 稳定糖聚合物基质存在下的一锅ATP测定。

在稳定糖聚合物基质中检测噬菌体介导的裂解：为了提高检测的稳定性和便携性，研究者们将所有试剂与噬菌体一起封装在由普鲁兰和海藻糖组成的糖基质中，制成了稳定的固体片剂。这种糖基质能够保护酶在生理温度下不被热失活，并且在干燥状态下能够保护噬菌体和酶的活性。实验结果表明，糖基质能够稳定ATP生物发光检测信号，减少信号衰减。将这些片剂干燥并储存一周后，重新溶解后仍能成功检测到噬菌体介导的细菌裂解。

图5. 稳定噬菌体生物库的大规模噬菌体文库筛选。

使用糖基ATP生物发光法筛选不同细菌种类对抗噬菌体库：研究者们使用糖基ATP生物发光法对多种耐药细菌菌株（包括铜绿假单胞菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）进行了噬菌体库筛选。结果显示，该方法能够在30-120分钟内识别出针对特定耐药细菌菌株的有效噬菌体，与传统的培养技术（如斑点测试和代谢活性监测）相比，具有更快的响应时间和更高的信号-噪声比。

本研究开发的基于糖基质的ATP生物发光法的高通量噬菌体筛选平台，为个性化噬菌体疗法中快速识别耐药细菌的靶标噬菌体提供了一种可靠、快速且便携的解决方案。该平台不仅提高了检测效率，还降低了操作难度，有望在资源有限的地区和紧急情况下广泛应用，为应对抗生素耐药性挑战提供了有力支持。

原文DOI：10.1038/s41467-024-49710-2