千份腹泻样本测序：解锁传染性肠道疾病诊断新法

感染性肠道疾病（急性胃肠炎）在英国每年约有1800万例，约25%的感染者会出现腹泻及相关胃肠道症状。目前英国用于识别粪便标本中胃肠道病原体的主要方法是传统的实验室技术，包括显微镜检查、抗原检测以及日益增多的分子检测方法，如核酸扩增技术。然而，传统方法和基于聚合酶链反应（PCR）的方法都存在局限性。传统方法聚焦于单一基因或一组特征，提供的病原体信息有限，且细菌培养耗时、敏感性低，难以培养苛养菌。基于PCR的方法虽提高了灵敏度，但也因靶向特定基因而无法实现菌株水平的区分，对于暴发监测不够理想，且只能检测已知基因，会遗漏意外病原体和独特基因。

宏基因组和宏转录组数据的分析速度和灵敏度因基于k-mer的方法显著提高，该方法已被广泛应用于许多工作流程中用于识别宏基因组样本中的病原体。但k-mer方法受测序错误和数据库全面性影响。宏基因组和宏转录组测序作为未来病原体检测的方法被提出，多组学方法在疾病亚型分类、生物标志物发现和功能分析等方面应用广泛，但在常规诊断框架内对社区获得性胃肠道病原体的系统评估有限。鉴于宏基因组和宏转录组在其他场景中的潜力，有必要对其进行基准测试以评估其性能。INTEGRATE研究比较了传统诊断方法与先进分子方法和基于基因组的微生物技术，本研究呈现了对1067名胃肠炎症状患者粪便微生物组的下一代测序数据，旨在系统评估宏基因组和宏转录组测序的诊断潜力，并将其性能与传统临床实验室胃肠道病原体诊断方法进行对比。

研究内容

图1. 视觉概述和比较DNA（宏基因组）和RNA（元转录组）测序读数分配给相关的胃肠道病原体英国设置。

宏基因组和宏转录组对胃肠道病原体的检测敏感性不同。对于空肠弯曲菌、隐孢子虫和贾第虫，宏转录组比宏基因组更敏感；而对于腺病毒科、艰难梭菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和小肠结肠炎耶尔森菌，宏基因组更敏感。两种方法均未检测到溶组织内阿米巴。

图2. 在英国，14种主要胃肠道群落病原体中的10种的测序数据和实验室检测结果之间存在统计学上显著的相关性。结果显示至少有一个统计上显著的相关性。

宏基因组和宏转录组检测到的胃肠道病原体与临床实验室结果具有可比性。大多数英国主要的胃肠道社区病原体在两种测序数据中均被检测到，但RNA病毒只能通过宏转录组检测到。对于病毒病原体，如腺病毒在两种测序数据和Luminex xTAG胃肠道病原体检测试剂盒（Luminex）结果间呈正相关；对于原生动物，宏转录组对隐孢子虫的检测敏感性远高于宏基因组；对于细菌病原体，不同病原体在不同测序数据和实验室诊断方法间的相关性表现各异。

图3. 腺病毒可以通过其基因组物质和转录物的表达，直接从粪便中检测到。

在腹泻相关的腺病毒检测中，尽管腺病毒是DNA病毒，但在RNA测序中也能检测到，且在部分样本中两种测序数据均能实现较高的基因组覆盖率。宏转录组分析还能从腹泻患者的粪便样本中生成沙门氏菌的完整转录组图谱，揭示了细菌在粪便样本中暴露于物理化学应激时的基因表达情况。此外，通过比较Campylobacter和艰难梭菌阳性与阴性样本的RNA/DNA比值，发现阳性样本的比值显著更高，可用于区分样本状态。

图4 通过金标准诊断，在弯曲杆菌和艰难梭菌检测呈阳性的样品中观察到更高的RNA/DNA比率。

宏转录组学提高了对某些病原体的检测敏感性，如隐孢子虫，还可通过RNA病毒作为生物标志物进行检测，且能提供更广泛的病原体检测范围，包括意外的病原体。然而，宏基因组测序在某些方面也有优势，如对DNA病毒的检测，尽管需要优化以更好地获取表达谱。此外，宏转录组学在检测某些病原体（如溶组织内阿米巴）时存在局限性，且对于大肠杆菌和志贺氏菌等基因组相似的病原体，基于分类学的相关性分析难以准确区分。同时，宏基因组和宏转录组测序面临高成本、基础设施需求和专业人员短缺等挑战。

通过足够的基准测试，可直接对临床样本进行测序以诊断各种胃肠道病原体。宏转录组学可检测活跃的DNA病毒，并通过RNA病毒作为生物标志物提高对原生动物的检测敏感性。本研究首次系统比较了宏转录组学与传统诊断方法在英国胃肠道病原体监测中的优势，表明宏转录组学可能比宏基因组学更具价值。尽管存在一些局限性，但宏转录组学为临床诊断提供了有前景的方法，未来还需进一步优化以更好地应用于临床实践。

原文链接：https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-025-01478-w