CRISPR-Cas12a遇上适配体：打造磺胺残留与耐药基因超灵敏检测“终结者”

抗生素在医疗和水产养殖业中至关重要，但低效吸收导致其通过排泄物进入水源积累成环境污染物。由于环境抗生素浓度深刻影响细菌耐药性演化，同步检测生态系统中的抗生素污染及ARGs（如磺胺类相关基因）可预测耐药规律并指导感染治疗。磺胺类抗生素因广谱抗菌性被广泛应用，但其稳定结构导致环境难降解而广泛累积；长期暴露不仅破坏微生物生态、对水生生物造成氧化损伤，更在低剂量选择压下促进耐药基因（如sul1、sul2）扩散。

本研究创新性地整合适配体与CRISPR技术，构建可同步检测SMZ和sul1基因的多模式平台（Fig. 1）：利用四氧化三铁-聚多巴胺磁性载体（FP@cDNA）固定互补DNA，通过SMZ与适配体（Apt-ROX）的特异性结合竞争引发荧光信号变化；设计高过氧化物酶活性/电催化性能的MOF-818@PtPd纳米酶（MPP），借助Zr-O-P键连接磷酸化ssDNA并锚定于磁珠或电极；当sul1激活CRISPR/Cas12a反式切割能力时，可裂解ssDNA释放MPP——磁分离后MPP催化TMB-H₂O₂显色（比色/光热检测），电极表面ssDNA断裂则降低MPP负载量，削弱其电催化还原H₂O₂的电流（电化学检测）。

Figure 1  （A） Fe3O4@PDA、磁分离装置的构建和基于罗丹明 B 修饰适配体 （Apt-ROX） 的 SMZ 检测的优势。（B） MOF-818@PtPd （MPP） 的活性和 CRISPR/Cas12a 的切割功能，由 sul1 在与 crRNA 结合时触发，能够通过比色、光热和电化学方法对 sul1 进行三模式检测。（C） SMZ 和 sul1 同时监测示意图及基于连续监测的预测模型构建

SMZ-sul1 多模式检测平台原理：

基于CRISPR的SMZ和sul1检测系统无需复杂的核酸扩增技术和昂贵设备：首先通过迈克尔加成反应将FP表面的儿茶酚基团与氨基修饰DNA（cDNA-NH2）连接构建分离单元（FP@cDNA）；一方面通过Apt-ROX与SMZ及FP@cDNA的竞争性结合结合后续磁分离实现SMZ检测，另一方面利用3'端氨基修饰、5'端磷酸化修饰的核酸链（P-ssDNA-NH2）作为FP与MPP纳米材料的连接桥——当crRNA与sul1结合时触发Cas12a切割功能，释放MPP纳米颗粒实现磁分离后的比色和光热检测；同时通过Au-S键将5'端硫醇修饰、3'端磷酸化修饰的单链DNA（P-ssDNA-SH）固定在电极表面作为连接体，当Cas12a激活时随机切割电极表面的P-ssDNA-SH，阻碍MPP纳米颗粒通过Zr-O-P键在电极表面的组装，导致MPP催化H2O2电化学还原电流降低从而实现sul1精确定量；这种整合荧光、比色、电化学和光热技术的多模式检测方法为环境样品中SMZ污染和sul1基因的同步监测提供了创新范例。

零部件制备：

本研究成功制备并表征了MPP纳米酶和FP磁分离单元：通过溶剂热法合成的Fe3O4纳米颗粒经多巴胺修饰形成FP复合材料，其超顺磁性可实现快速磁分离；同时采用原位沉积法在Zr/Cu基MOF-八面体表面负载Pt-Pd纳米颗粒制得MPP纳米酶，XPS（Fig. 2）和XRD分析证实其元素组成和晶体结构。基于FP@cDNA的SMZ荧光检测体系通过Mg2+介导将氨基修饰cDNA固定于FP表面，利用罗丹明B标记适配体（Apt-ROX）与SMZ的竞争结合，经磁分离后上清液荧光强度与SMZ浓度呈线性关系，检测限达0.67pM，对多种抗生素表现出优异选择性，且FP@cDNA在4℃储存15天仍保持稳定。同时，通过将3'端氨基修饰、5'端磷酸化的核酸链（P-ssDNA-NH2）作为连接桥，当crRNA与sul1结合时触发Cas12a切割功能释放MPP纳米颗粒，实现比色和光热检测；而通过Au-S键固定在电极表面的5'端硫醇修饰、3'端磷酸化单链DNA（P-ssDNA-SH）被Cas12a切割后，阻碍MPP纳米颗粒组装，降低电化学还原电流，从而精确定量sul1。

Figure 2  Fe3O4 和 Fe3O4@PDA （A） 以及 MOF-818 和 MPP （B） 的制备示意图。Fe3O4 （C） 和 Fe3O4@PDA 的 TEM 图像（D）.（E） 材料的磁性能宏观特征：Fe3O4，Fe3O4@PDA。（F） Fe3O4 和 Fe3O4@PDA 的磁滞曲线。（G） MPP 的 SEM 图像。（H） MPP 的 TEM 图像。（I） MPP 的 C、N、O、Cu、Zr、Pt 和 Pd 元素映射

磺胺类抗性基因 sul1 的比色检测：

采用3'端氨基修饰、5'端磷酸化的单链DNA（P-ssDNA-NH2）作为连接桥，通过XPS表征证实MPP与P-ssDNA-NH2之间形成Zr-O-P键，当crRNA识别sul1基因后激活Cas12a的反式切割活性，使FP连接的MPP纳米酶释放至上清液中催化TMB显色反应（Fig. 3A）。通过PAGE凝胶电泳验证了sul1/crRNA/Cas12a三元复合物对P-ssDNA-NH2的特异性切割（Fig. 3B），同时荧光报告系统（ssDNA-FQ）证实仅当sul1存在时才激活Cas12a的切割功能（Fig. 3C）。优化合成的MPP纳米酶在H2PtCl6/Na2PdCl4体积比7:3（总量200μL）时呈现最佳催化活性，其稳态动力学分析显示对H2O2和TMB的Km值分别为0.101mM和0.463mM，EPR谱图证实其催化机制涉及羟基自由基、单线态氧和超氧自由基的生成（Fig. 3E）。通过紫外吸收（260nm）和zeta电位变化验证了FP-ssDNA-MPP纳米探针的成功构建（Fig. 3F-H），优化实验确定最佳检测条件为：1mg/mLFP-ssDNA-MPP探针、Cas12a/crRNA比例1:1、37℃振荡孵育120min（1200rpm）。所构建的比色传感器在8pM-12.5nM范围内与sul1浓度的对数呈线性关系（LOD=1.43pM），且对sul2、tetA等耐药基因表现出高度特异性，稳定性测试表明4℃储存15天后活性保持90%以上。该体系通过磁分离富集（30s内完成）和CRISPR的特异性识别，为环境样品中sul1基因的检测提供了高灵敏、高特异的解决方案。

Figure 3  （A）基于FP-DNA-MPP和CRISPR/Cas12a的sul1比色检测过程示意图。（B）12%天然PAGE分析Cas12a的ssDNA反式切割能力。（C）荧光光谱分析Cas12a的ssDNA反式切割能力。（D）不同反应体系的紫外-可见光吸收光谱，MPP + H2O2 + TMB、MPP + TMB、MPP + H2O2、H2O2 + TMB、TMB和H2O2。（E）MPP + H2O2与DMPO/TEMP作为自旋捕获剂的EPR光谱。（F）P-ssDNA与MPP相互作用前后上清液中P-ssDNA在260 nm处的紫外-可见吸光度变化。（G）MPP、ssDNA-MPP和FP-ssDNA-MPP探针的催化能力的紫外-可见吸收光谱。（H）MOF-818、MPP、MPP@ssDNA和FP-ssDNA-MPP的电位值

磺胺类抗性基因 sul1 的光热检测

基于TMB氧化产物(oxTMB)的近红外光热特性，本研究开发了一种新型CRISPR/Cas12a介导的sul1基因光热检测方法：oxTMB在808nm近红外激光照射下表现出显著的光热转换效应（48.7±2.1%效率），当MPP纳米酶催化TMB氧化生成oxTMB后，其浓度与温度升高呈正相关（40μM oxTMB在0.9W激光照射5分钟内温度从25.6°C升至72.8°C）；通过优化实验建立的光热检测体系显示，仅当sul1与crRNA/Cas12a共存时才触发显著的温升效应（ΔT），在40pM-12.5nM范围内ΔT与sul1浓度对数呈线性关系（ΔT=11.749lgC+22.137，r=0.998），检测限达14.7pM；该体系对sul2、tetA等常见耐药基因表现出高度特异性，验证了将CRISPR特异性识别与纳米酶催化光热信号放大相结合的技术可行性，为环境耐药基因监测提供了新型可视化检测工具。

磺胺类抗性基因 sul1 的电化学检测：

研究通过将Pt-Pd纳米颗粒修饰的MOF-818纳米复合材料（MPP）与靶标激活的CRISPR/Cas12a系统相结合，开发了一种高灵敏度、高特异性的电化学生物传感器用于检测磺胺类抗生素耐药基因sul1。MPP纳米酶展现出优异的电催化活性（H2O2还原峰电位-0.08V vs. Ag/AgCl），当crRNA识别sul1后激活Cas12a切割电极表面硫醇/磷酸化修饰的单链DNA（P-ssDNA-SH），导致通过Zr-O-P键组装的MPP纳米酶减少，从而降低H2O2还原电流（Fig. 4A）。通过优化Cas12a/crRNA比例（1:1）、P-ssDNA探针浓度（1μM）和电极制备时间（60分钟）等关键参数，该传感器在10fM-10nM范围内呈现良好的线性关系（ΔI=13.267lgC+69.978，r=0.998），检测限达7.6fM（Fig. 4D），较现有方法具有显著灵敏度优势。特异性实验表明，仅sul1能显著改变DPV信号（Fig. 4E-F），且MPP在4℃储存15天后仍保持80.7%的催化活性（Fig. 4G）。这种将CRISPR精准识别与纳米酶高效催化相结合的策略，实现了对sul1基因的超灵敏检测，为环境耐药基因监测提供了强有力的技术手段。

Figure 4  （A）基于MPP和CRISPR/Cas12a的sul1电化学检测过程。（B）MPP和基于CRISPR/Cas12a的sul1电化学检测的可行性实验。（C）在sul1（10 fM-10 nM）存在下的反应溶液的DPV。（D）∆I%变化与sul1基因浓度的关系图。插图：相关的线性校准曲线。MPP的特异性（E）、抗干扰（F）和长期稳定性测试（G）以及基于CRISPR/Cas12a的sul1电化学检测过程

该研究通过整合CRISPR与适配体技术，成功构建了基于磁性纳米复合物的多模式检测平台，实现了磺胺二甲嘧啶（SMZ）及其耐药基因sul1的同步检测。该平台采用适配体竞争结合机制（Apt-ROX/SMZ/FP@cDNA）实现SMZ的高特异性荧光检测，灵敏度达0.67 pM；同时利用MPP纳米酶的高效过氧化物酶活性和电催化活性，开发了sul1的三模式检测体系——比色法（1.43 pM）、光热法（14.7 pM）和电化学法（7.6 fM）。环境样本连续加标实验证实，该SMZ-sul1多模式检测平台能有效追踪污染物浓度与耐药基因丰度的变化趋势。该技术的突出优势在于：仅需更换适配体识别序列和crRNA即可拓展应用于其他抗生素及其耐药基因的检测，为环境抗生素污染及耐药性传播风险监测提供了通用型解决方案。

原文doi：https://doi.org/10.1186/s12951-025-03463-2