沙门氏菌作为全球主要食源性病原菌，可通过污染食品引发感染，最低1CFU即可致病，传统检测方法（如平板计数、PCR）存在耗时、操作复杂或依赖专业设备等问题。磁弛豫开关（MRS）传感器因快速、灵敏等优势被广泛研究，但现有MNP-basedMRS传感器存在纳米颗粒聚集导致的稳定性不足，且多依赖间接信号调控。水凝胶的溶胶-凝胶转变可直接影响水分子弛豫行为，为MRS信号输出提供新途径，但传统三明治结构易受非特异性结合干扰。

CRISPR-Cas12a系统因其高特异性识别和反式切割能力，成为生物检测的理想工具。本研究整合CRISPR-Cas12a的精准调控与水凝胶溶胶-凝胶转变的直接信号输出，构建MRS-CRISPRbiosensor：利用CRISPR-Cas12a识别沙门氏菌invA基因，调控碱性磷酸酶（ALP）的结合，通过ALP催化反应释放Ca²⁺诱导水凝胶化，进而改变横向弛豫时间（T₂）实现检测。该设计克服了传统MRS传感器的间接信号缺陷及非特异性结合问题，为食源性病原菌快速检测提供新思路。

方案1.基于藻酸盐水凝胶溶胶-凝胶过渡的沙门氏菌检测MRS-CRISPR生物传感器传感原理示意图。

研究内容

图1.MRS-CRISPR生物传感器的可行性

MNPs成功偶联ssDNA，透射电镜（TEM）显示其直径约200nm的球形结构，荧光探针实验和尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（urea-PAGE）证实CRISPR-Cas12a系统可特异性切割靶DNA，释放荧光信号。Ca²⁺触发海藻酸钠溶胶-凝胶转变，流变学测试显示凝胶的储能模量（G’）高于损耗模量（G''），形成三维网络结构；肉眼可见溶胶在CaCl₂存在时变为凝胶，证实相变成功。仅当Cas12a、crRNA和靶DNA同时存在时，ΔT₂显著升高（约400ms），而缺失任一组件时ΔT₂接近背景值，验证了CRISPR-Cas12a激活、ALP结合抑制及水凝胶相变的级联反应可行性。

图2.测定条件的优化

0.5%时ΔT₂最大，浓度过高会因Ca²⁺不足导致凝胶化不完全，过低则网络结构稀疏，信号变化不显著。50mM为最佳，低浓度时AA生成量不足，Ca²⁺释放效率低；高浓度时非特异性酸释放引发背景干扰。1:1200时催化效率最高，进一步稀释会降低酶与底物的结合概率，导致凝胶化效率下降。通过响应面法系统调整参数，确保ALP催化效率、Ca²⁺释放量与水凝胶相变程度的协同优化，最终确定最佳检测条件，为灵敏度提升奠定基础。

图3.MRS-CRISPR生物传感器的检测性能

线性检测范围为3.16×10²–1.6×10⁷CFU/mL，检测限（LOD）158CFU/mL，优于多数基于磁性纳米颗粒的磁弛豫传感器（如传统MNP-basedMRS传感器LOD通常>500CFU/mL）。对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和痢疾志贺氏菌等非靶菌的ΔT₂<100ms，仅沙门氏菌组ΔT₂≈400ms，归因于crRNA对沙门氏菌invA基因的高特异性识别（严格碱基配对与PAM序列匹配）。与荧光、电化学等CRISPR检测方法相比，该传感器利用T₂信号直接反映水分子弛豫行为，抗干扰能力强，且检测成本约3.7美元/次，低于商用ELISA试剂盒。

本研究开发的MRS-CRISPR传感器通过整合CRISPR-Cas12a的特异性识别与水凝胶溶胶-凝胶转变的直接T₂信号输出，实现沙门氏菌的超灵敏检测，检测限158CFU/mL，实际样品中回收率良好。该方法克服了传统MRS传感器的间接信号缺陷，为食源性病原菌检测提供了新策略。未来可通过微流控技术简化操作流程，结合快速DNA提取方法提升效率，并优化crRNA序列拓展至其他病原菌检测。尽管目前依赖专业NMR设备，但便携式低场核磁共振技术的发展有望推动其现场应用

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.142693