单管搞定多重SNP检测：CRISPR/Cas12a-RCA技术让结核耐药筛查“一步到位”

结核病的高发病率和死亡率对公共卫生构成了重大威胁。2022 年，全球约有1060万新增病例和130万相关死亡病例。随着耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）病例的增加，传统检测方法的不足逐渐凸显。例如，痰培养耗时长，干扰素-γ释放试验（IGRAs）无法区分活动性感染和潜伏感染。目前的分子检测技术包括实时荧光PCR、GeneXpert MTB/RIF、环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）等，但这些技术存在操作复杂、依赖专用设备、成本高或灵敏度有限等问题。等温扩增技术如LAMP、RPA与CRISPR/Cas系统结合可提升检测性能，但LAMP易出现非特异性扩增，RPA需多酶协同，易出错。滚环扩增（RCA）技术因引物设计简单、无需多酶协调，可减少非特异性扩增风险。此前虽有研究将RCA与CRISPR/Cas12a结合用于检测，但未实现单核苷酸多态性（SNPs）多重检测，现有RCA相关方法多局限于单个SNP检测。鉴于此，本文旨在开发一种结合RCA与CRISPR/Cas12a技术的新方法，实现单管中并行检测多个结核分枝杆菌耐药相关SNPs。

其工作原理如图1所示，通过锁式探针（PL）与目标DNA的特异性结合启动反应。当目标DNA含耐药相关SNP时，PL可被DNA连接酶环化为单链环状DNA，作为RCA扩增模板；野生型DNA因碱基错配无法形成环状模板。环状DNA经Phi29 DNA聚合酶扩增后产生含gRNA互补序列的产物，激活Cas12a的非特异性ssDNA切割活性，使荧光报告分子释放荧光信号，通过紫外灯可裸眼观察结果。

该方法能够灵敏（检测限低至10⁴ aM）且特异地检测目标SNPs的存在，与其他常见临床细菌（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等）无交叉反应。值得关注的是，该方法通过离心管完成实验。内管负责PL的连接反应，先经95℃变性3分钟使目标DNA解链，再于37℃恒温孵育20分钟，让PL与含SNP的目标DNA特异性结合并在DNA连接酶作用下环化。外管则预装RCA与CRISPR/Cas12a系统所需试剂，包括Phi29 DNA聚合酶、dNTPs、Cas12a蛋白、gRNA及荧光报告探针等。待内管连接反应完成后，通过简单离心使内管产物进入外管，37℃水浴孵育2小时即可完成扩增与信号释放，整个过程无需复杂仪器操作，结果可通过紫外灯裸眼观察荧光有无来判断。基于此方法，利用临床样本开展的验证实验进一步证实了其可靠性。对16份临床痰样本及支气管肺泡灌洗液样本的检测结果显示，该方法对利福平耐药结核分枝杆菌的检出结果与Sanger测序结果高度一致，灵敏度为100%，特异性为83.3%，阳性预测值为90.9%，阴性预测值为100%（图3和表1）。这表明该方法能有效避免耐药病例的漏诊，为临床快速决策提供可靠依据。

总之，本文开发的RCA-Cas12a-Multi-SNP单管方法在结核分枝杆菌耐药相关SNPs检测中展现显著创新：通过整合锁式探针特异性识别、RCA 高效扩增与 CRISPR/Cas12a 信号放大技术，实现单管内多重SNP并行检测，操作简化为变性-连接-扩增的三步流程，无需复杂仪器，结果可裸眼判断，适配基层场景。这种集高灵敏度、特异性与操作便捷性于一体的单管检测系统，不仅简化了结核耐药相关SNPs的检测流程，更降低了对专业设备和技术人员的依赖，为基层医疗机构及资源有限地区的结核病耐药筛查提供了实用解决方案。然而，该方法也存在一定的局限性：阳性结果仅提示存在至少一个目标SNP，无法区分具体突变位点；特异性虽达83.3%，仍有少量假阳性可能；检测限对极低浓度样本覆盖不足。未来可通过多通道荧光设计和探针优化进一步提升性能，拓展其在病原体检测中的应用价值。

图1  本研究的方法原理示意图

图2  RCA-Cas12a-Multi-SNP 方法的灵敏度和特异性评估示意图。（a）灵敏度表征。（b）灵敏度表征的终点荧光柱状图。（c）特异性示意图。

图3  RCA-Cas12a-Multi-SNP单管方法的临床验证及与测序结果的比较示意图。（a）RCA-Cas12a-Multi-SNP单管方法的临床操作流程图。（b）RCA-Cas12a-Multi-SNP单管方法的紫外灯观察结果与测序结果的比较。 

表1  RCA-Cas12a-Multi-SNP 单管方法与测序结果的比较

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.microc.2025.113037