基于纳米抗体的双模传感平台，用于高灵敏度检测黄曲霉毒素B1

1.引言

黄曲霉毒素 B1（AFB1）毒性极强且为 Ⅰ 类致癌物，广泛污染食品饲料，全球已设严格最大残留限量法规。传统检测方法如 HPLC、HPLC-MS/MS 等虽灵敏准确，但操作复杂、依赖贵仪器，难满足实时检测需求。LFIA 因无需复杂条件和专业知识成快速检测优选，然传统 LFIA 依赖 AFB1-BSA 等抗原，成本高且有害，需寻高特异性、环保的抗原替代品，纳米抗体因多优势成重要方向，其与 AP 融合后亲和力可提升。同时，AuNPs 基 LFIA 信号亮度与灵敏度不足，而含光热响应材料的双模式 LFIA 前景好，钼基氧化物经优化可提升光热转换效率，为 LFIA 性能提升提供可能。

本研究开发了一种基于纳米抗体的双模式 LFIA 传感平台，通过制备纳米抗体 - 碱性磷酸酶融合蛋白（AP2-5）替代传统抗原，并合成新型双模式信号示踪剂 Cu-MoOx 纳米颗粒（CMO），构建比色 / 光热双模式 LFIA 系统，实现对食品中 AFB1 的快速、高灵敏检测，为食品安全控制和公共卫生保障提供新方法。

方案 1.（A）AP2-5的制造工艺;（B）双信号免疫测定的原理和优越性;（C）AP2-5和Nb2-5对单克隆抗体的亲和力比较。

2.结果与讨论

CMO 的合成与表征：一步水热法合成 CMO 纳米花，其呈花瓣状，含 C、O、Cu、Mo 且分布均匀，晶体结构完好，有大量氧空位，与抗体结合力强，808nm 处有宽吸收。

图1.CMO 的表征。（A）CMO的合成工艺图;（B）透射电镜图像;（C）HAADF图像和EDS元素图谱;（四）单克隆抗体附着前后AuNPs和CMO的Zeta电位（E）粒径分布统计;（F）粉末XRD光谱;（G）CMO和MoOx-NPs的紫外吸收光谱;（H）XPS光谱;（I，J）Mo 3d和O 1s区域CMO的高分辨率XPS光谱。

CMO 光热性能评估：CMO 浓度、激光功率与升温正相关，四次光热循环稳定性好，转换效率 45.58%，优于 MoOx-NPs，电场模拟显示其热点密度高，适合做 LFIA 示踪剂。

图2.CMO的光热特性。（A）不同浓度（808 nm，2.0 W cm^-2）CMO的热图像和（B）光热加热剖面);（C）CMO在不同激光功率照射（300 μg mL^-1）下的光热加热特性);CMO（D）和MoOx-NPs的温度曲线;（E） 在暴露于一个开/关循环的 808 nm 激光照射（300 μg mL^-1）温度曲线，冷却时间与温度驱动力的负自然对数的关系图;（F）CMO和MoOx-NPs在激光照射的四个开/关循环（808 nm，2.0 W cm^-2);808 nm 近红外辐照下 （G） CMO 和 （H） MoOx-NPs 的近电磁场分布。

免疫探针性能测定：CMO 与抗体偶联效率（79.10%-94.68%）高于 AuNPs，且下降慢；AP2-5 与单克隆抗体的亲和力是 Nb2-5 的 5 倍以上，优势显著。

图3.CMO偶联单克隆抗体的有效性及融合蛋白的性能评价。（A）CMO和AuNPs与单克隆抗体偶联过程示意图;（B）AP2-5的OD450nm与抗AFB1单克隆抗体浓度的回归方程;评估CMO（C）、Au NPs（D）与AP2-5的偶联效率，第1-5组对应于抗体添加量为5、10、15、20和25 μg;Nb2-5（E）和AP2-5（F）对单克隆抗体的亲和力测定;（G） AP2-5 和 Nb2-5 之间 Ka 的比较。

LFIA 灵敏度评估：CMO-LFIA 双模式检测限低，光热模式更优，灵敏度远超 AuNPs-LFIA，双信号可交叉验证，试纸条和探针在不同条件下储存稳定性好。

图4.CMO-LFIA用于AFB1检测的分析性能评估。（A） 基于 0-2 ng mL ^-1的 CMO 比色测定图像AFB1浓度;（B）光热测定图像;（C） 基于 0–6.66 ng mL^-1的 AuNP 比色测定图像AFB1浓度;（D-F）校准曲线对应于三种测定。插图：与三种测定相对应的线性响应;（G）CMO-LFIA在比色和光热模式下检测AFB1的特异性评估;（H）比色和光热模式下T线的灰度强度和ΔT;（I） 使用双模 CMO-LFIA 免疫传感器分析燕麦片、玉米和大豆中的 AFB1（值表示为均值，n = 3）。

3. 结论

本研究成功开发基于纳米抗体的 CMO-LFIA 检测系统，整合 AP2-5 介导的比色 / 光热双模式，CMO 具高比色强度、45.58% 光热转换效率及 79.10%-94.68% 抗体偶联效率。创新用二价融合蛋白替代传统抗原，实现 0.0191ng・mL⁻¹ 低检测限与 85.07%-117.03% 回收率，且安全环保，为谷物 AFB1 检测提供可持续方案，推动绿色免疫分析发展。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117811