基于PolyHRP信号增强的食源致病菌免疫检测技术新突破

一、研究背景

食源性致病菌引发的公共卫生危机持续威胁全球食品安全。据美国疾控中心数据，大肠杆菌O157:H7（E. coli O157:H7）和鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）是两大高危病原体：前者年致7.3万例感染，最低感染剂量仅10-100个细菌；后者占欧盟食源性疾病暴发首位。传统培养法耗时24-48小时，难以满足快速检测需求。酶联免疫吸附测定（ELISA）虽具操作简便优势，但其传统比色模式灵敏度不足，亟需技术升级。

二、技术创新原理

浙江大学研究团队提出聚合辣根过氧化物酶（PolyHRP）信号放大系统，通过增加单个结合事件中酶分子负载量，显著提升检测灵敏度。核心技术对比见图1：

图1：PolyHRP通过链霉亲和素载体搭载多HRP分子（右），较传统单HRP系统（左）产生指数级信号增强。

三、方法优化与验证

1. 抗体与反应体系优化

团队制备得到高纯度多克隆抗体，经SDS-PAGE验证抗体纯度达95%以上：

图2 抗大肠杆菌 O157:H7 和抗鼠伤寒沙门氏菌血清及多克隆抗体（pAb）的表征（用于抗体制备）。分别用大肠杆菌 O157:H7（A）和鼠伤寒沙门氏菌（B）免疫两只家兔后的血清效价测定，以确保成功获得抗体来源。（C）通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对抗大肠杆菌 O157:H7、抗鼠伤寒沙门氏菌的血清及纯化后的多克隆抗体进行表征。

通过单因素实验确定最佳检测参数：

•捕获/检测抗体浓度：E. coli O157:H7为1μg/mL，S. Typhimurium为2μg/mL

•封闭剂：5%脱脂牛奶（较BSA降低非特异性结合60%）

2. 灵敏度突破

PolyHRP系统使检测限（LOD）实现数量级突破：

图3 基于双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA），在相同条件下分别采用链霉亲和素 - 聚合辣根过氧化物酶（SA-PolyHRP）和链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶（SA-HRP）检测大肠杆菌 O157:H7（A）和鼠伤寒沙门氏菌（B）所得的定量曲线。误差线代表标准差（n=3）。

3. 特异性与抗干扰能力

交叉实验证实，系统对李斯特菌等6类非目标菌零交叉反应：

图4 基于链霉亲和素 - 聚合辣根过氧化物酶（SA-PolyHRP）的双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大肠杆菌 O157:H7（A）和鼠伤寒沙门氏菌（B）的特异性分析（与其他食源致病菌及大肠杆菌菌株对比，菌浓度均为 10⁶ CFU/mL）。插图分别为检测大肠杆菌 O157:H7（A）或鼠伤寒沙门氏菌（B）与其他致病菌、大肠杆菌菌株的标准曲线（浓度范围 10²-10⁸ CFU/mL）。误差线代表标准差（n=3）。

基质干扰研究显示：牛肉样本经10倍（E. coli）或100倍（S. Typhimurium）稀释即可消除基质效应，回收率达84%-130%。

四、实际应用效能

在牛肉样本加标实验中，该方法实现：

表1 双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）与平板计数法检测牛肉样品中大肠杆菌 O157:H7 和鼠伤寒沙门氏菌的结果比较。

•5 CFU极低接种量检出：5小时富集后成功检测。

•与平板计数法高度吻合：E. coli检出值2.8×10⁸ CFU/mL vs 平板法2.3×10⁸ CFU/mL。

五、技术优势与行业价值

较现有技术，本方案具备三大突破：

 应用前景：该技术为食品供应链提供高性价比快检方案，尤其适用于资源有限的基层检测机构。团队正推进试剂盒开发，未来可扩展至乳制品、农产品等多场景监测。

六、结论

PolyHRP信号放大技术成功突破传统ELISA灵敏度瓶颈，为食源性致病菌监测提供兼具高灵敏、强特异性、操作简便的新型解决方案，有望成为食品安全风险防控的关键技术支撑。

参考文献：

Zhang Y, Pan J, He Q, et al. Development of Immunoassays for Foodborne Pathogenic Bacteria Detection Using PolyHRP for Signal Enhancement[J]. Biosensors, 2025, 15(5): 318.