无标记电化学生物传感器，用于使用非法拉第 EIS 实时检测沙拉样品中的活鼠伤寒沙门氏菌

      1.引言

食源性疾病是重大全球公共卫生问题，每年全球因食源性病原体导致 6 亿人患病、420,000 人死亡，美国约六分之一人口受此影响。鼠伤寒沙门氏菌作为常见且有害的菌株，传染性强，能在多种环境存活，近年在新鲜农产品中引发的疫情增多，20–100 CFU 就可致病。传统检测方法耗时、费力且需专业设施，现代替代方法也存在局限，而现有多数生物传感器无法区分死活细菌，易致假阳性，因此亟需能快速、特异性检测活菌的方法。

本研究开发了一种基于 ZnO/Au 修饰电极的无标记电化学生物传感器，通过非法拉第电化学阻抗谱（EIS）技术，以 DTSSP 为交联剂固定抗体，构建特异性检测系统，实现对沙拉样品中活鼠伤寒沙门氏菌的实时检测。该传感器检测限达 9 CFU/mL，5分钟内完成检测，可区分活菌与灭活菌，加标回收率良好，重复性高，与 ELISA 相关性强（r=0.98），分类准确率 91.11%，为食品安全检测提供了高效方法。

图 1. Read 平台上免疫分析构建方案的示意图，该方案可通过 EIS 技术检测活沙门氏菌。

2. 研究内容

多重传感器制备与改性：通过 ATR-FTIR 光谱、循环伏安图等，确认 ZnO/Au 电极经 DTSSP 功能化及抗体偶联成功，活菌在 ELISA 中吸光度更高，结合更好。

图 2. (A) ATR-FTIR 光谱显示 ZnO/Au 表面经 DTSSP 功能化（蓝色）后，再与鼠伤寒沙门氏菌抗体偶联（红色），通过特征性的巯基、NHS 酯和酰胺-I 峰确认了成功固定。 (B) 在 PBS（pH ∼7.4）中记录的裸 ZnO/Au、DTSSP 修饰和抗体功能化的 ZnO/Au 电极的循环伏安图，显示每次表面修饰后电流响应均降低。 (C) 用于生物传感的 ZnO/Au 传感器阵列的 HIROX 显微图像。 (D) 基于 ELISA 的比较分析抗体与活体和 UV 灭活的鼠伤寒沙门氏菌结合情况（浓度 9-729 CFU/mL）。活菌始终在 450 nm 处产生显著更高的吸光度值，表明更强的抗体-抗原相互作用，这可能是由于完整的膜结构和表位呈现所致。对照组未观察到显著响应。采用单因素方差分析结合 Tukey 事后检验评估统计学意义（***p < 0.0001）。误差线代表标准差（n = 6）。 （关于本图例中颜色引用的解释，请参阅本文的网页版本。

制造工艺的优化和质量控制: Bode 图、Nyquist 图显示传感器阻抗随活菌浓度变化，能区分活菌与灭活菌，ZnO 纳米结构提升灵敏度。

图 3. (A) Bode 图显示了阻抗幅值（|Z|）随频率变化的关系，对应不断增加的鼠伤寒沙门氏菌（活菌）浓度（0-729 CFU/mL）。|Z|的逐渐降低表明由于细菌结合导致界面变化增强。(B) Nyquist 图表示虚部（-Z″）与实部（Z′）的阻抗分量。尾部逐渐向右移动和展宽与细菌负荷增加相关，这与 ZnO/Au 表面抗体-抗原相互作用引起的电双层修饰和界面破坏增加相一致。(C) 鼠伤寒沙门氏菌的存活率选择性检测显示了活菌（绿色）、紫外线灭活的细菌（橙色）和混合群体的浓度依赖性阻抗响应。通过单因素方差分析结合 Tukey 事后检验确定统计学显著性（n = 8）（∗∗∗p < 0.001, ∗∗∗∗p < 0.0001）。(D) 非法拉电化学阻抗谱（EIS）机制的示意图，在功能化的 ZnO/Au 表面，抗原-抗体结合诱导双电层中的介电变化，而无需发生氧化还原反应。

图 3B 展示了在非法拉第条件下，不同浓度鼠伤寒沙门氏菌（0–729 CFU/mL）的阻抗谱（Z real vs. Z imag ）。随着细菌浓度的增加，曲线逐渐向右移动，表明电极-电解质界面处阻抗发生系统性变化。不同于经典法拉第体系中半圆曲线反映氧化还原活性导致的电荷转移电阻（R ct ）；我们的非法拉第平台的阻抗特征源于生物分子结合引起的电容和介电扰动。这些变化受电双层（EDL）变化调控，其中抗体-抗原相互作用增加空间位阻并改变局部介电特性。这导致界面极化增强，从而在高浓度下观察到更宽的阻抗尾部。缺乏氧化还原介质证实阻抗主要由 C dl 和界面介电常数主导，而非电子转移过程。ZnO 纳米结构通过增加表面积和支持稳定的抗体固定来提高灵敏度。 这些趋势验证了传感器通过纯电容响应检测细菌负荷的能力，确认了其在复杂样品中进行无标记、选择性检测的适用性。图 3C 展示了生物传感器在不同浓度下选择性检测活鼠伤寒沙门氏菌的能力。活菌组（绿色条形）表现出明显的浓度依赖性阻抗响应增加，在729 CFU/mL时达到约 63%。这种增强的信号可归因于活细胞表面原生抗原表位的保存，特别是完整的脂多糖（O-抗原）和鞭毛（H-抗原）结构，这些结构促进了有效的抗体结合。相比之下，紫外线灭活的细菌（橙色条形）产生的响应明显减弱，峰值约为 28%。这种减少与紫外线诱导损伤导致的表面表位结构改变一致，这种损伤损害了抗体识别，同时保持了整体细胞形态完整。 混合种群（蓝色条形）产生中间信号，反映了活细胞与失活细胞的比例。统计分析证实，在测试的不同剂量下，活细胞组与死细胞组之间存在显著差异（p < 0.001 至 p < 0.0001），在最低浓度下未检测到显著差异。虚线表示传感器的检测限。

改进传感器的加标回收与重复性评估研究: 加标回收实验回收率良好， intra - 和 inter-assay 的 % CV 低于 20%，重复性佳，传感器对目标菌反应强，干扰小。

图 4. (A) 传感器平台对掺入沙拉浸泡水中的鼠伤寒沙门氏菌的阻抗响应百分比，浓度范围从 18 至 486 CFU/mL。(B) 重复性试验变异系数 (%CV, n = 8) 和 (C) 间批变异系数 (%CV, n = 4)，均显示在 CLSI 标准范围内的高重现性 (<20%)。(D) 特异性评估 (n = 6)，比较了鼠伤寒沙门氏菌与大肠杆菌在不同浓度（低 10 CFU/mL，中 100 CFU/mL，高 700 CFU/mL）下的信号响应。(E) 交叉反应性分析 (n = 8)，选择了两组：特异性鼠伤寒沙门氏菌和非特异性大肠杆菌，每组在三种浓度（低、中、高）下进行测试。特异性响应标记为 SL、SM 和 SH，相应的非特异性响应标记为 NSL、NSM 和 NSH。该生物传感器对鼠伤寒沙门氏菌表现出强反应性，而大肠杆菌的干扰极小。

生物传感器性能与 ELISA 及分类器模型的比较研究: 生物传感器与 ELISA 相关性高，PCR 验证有效，分类准确率 91.11%，ROC 曲线 AUC 为 0.88，诊断能力强。

图 5. (A) 所开发的生物传感器与 ELISA 的相关性分析，显示在五个浓度水平上具有高度一致性。(B) 对污染沙拉样本中鼠伤寒沙门氏菌的 invA 基因进行 PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳显示预期条带大小，确认病原体存在。(C) 混淆矩阵展示了生物传感器的分类性能，计算值：PPV = 85.29 %，NPV = 90.06 %，准确率（ACC）= 91.11 %。(D) 受试者工作特征（ROC）曲线下面积为 0.88，表明在区分安全样本与污染样本方面具有高诊断能力。

3.结论:

本研究成功开发基于 ZnO/Au 电极的无标记电化学生物传感器，采用非法拉第 EIS 技术，实现对沙拉中活鼠伤寒沙门氏菌的特异性检测。该传感器检测限达 9 CFU/mL，5 分钟内完成检测，能区分活菌与死菌， intra - 和 inter-assay 的 % CV 低于 20%，加标回收率良好，与 ELISA 相关性高（r=0.98），分类准确率 91.11%，为食品安全检测提供高效、可靠的现场解决方案，推动食源性病原体快速检测技术发展。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117961