设备藏“菌”？乳制品携“抗”？双组学技术解锁白奶酪生产的食品安全关键节点

白奶酪是土耳其传统乳制品，通过酶凝乳工艺以巴氏杀菌或未杀菌牛奶制成，可鲜食或熟化后食用，在该国广泛生产，与希腊菲达奶酪、保加利亚西里内奶酪等区域品种类似。其微生物群随生产进程变化，发酵初期以乳球菌和肠球菌为主，后期乳杆菌占优，且原料乳微生物直接影响终产品的感官特性与安全性。工业生产中，巴氏杀菌无法完全消除耐热致病菌（如金黄色葡萄球菌）及形成芽孢的细菌（如梭状芽孢杆菌），且杀菌后设备表面或非发酵剂乳酸菌引起的二次污染仍可引入致病菌或腐败菌，威胁产品安全。此前研究已指出，发酵剂、盐水、奶酪桶等是乳制品厂微生物污染的关键节点，但传统依赖培养的检测方法难以识别活的非可培养微生物，也无法全面呈现微生物多样性。近年来，宏基因组学等高通量测序技术虽为微生物负荷与食源性致病菌风险分析提供了更深入的视角，但土耳其尚无研究整合蛋白质组学（MALDI-TOF MS）与鸟枪法宏基因组学技术，系统评估小型乳制品厂白奶酪生产过程的微生物安全与耐药组动态。因此，本研究结合两种技术，旨在评估白奶酪生产过程的微生物安全性、原料乳热处理效果、设备与生产表面潜在污染源及终产品微生物负荷，同时探究抗生素耐药基因在生产环境中的分布与传播特征，以揭示其对食品安全与公共健康的潜在影响，为传统乳制品体系的安全管理提供科学依据。

研究收集了包括原料奶（N1）、添加发酵剂的牛奶（N2）、凝乳（N3）、凝块（N4）、终产品白奶酪（N5）在内的乳制品样本，以及环境样本如运奶车（N6）、奶酪罐（N7）、搅拌器（N8）、切割线（N9）、奶酪布（N10）等在内的十个样本，利用MALDI-TOF MS技术（针对可培养病原菌进行物种水平鉴定）和鸟枪法宏基因组测序（分析微生物群落结构、抗生素抗性基因及功能特性），对样本中的微生物及耐药特征开展综合分析。研究发现，不同生产环节及设备表面的微生物群落存在显著差异。乳制品样本（N1-N5）中的金黄色葡萄球菌相对丰度最高，尤其在终产品白奶酪中达到约37%，显示其在加工及储存过程中具有较强的生存与适应能力。相比之下，设备样本（N6-N10）中该菌丰度较低，但仍能在多处被检出，提示可能通过环境或人员操作造成交叉污染。沙门氏菌主要集中在奶酪罐、搅拌器与切割线等设备上，表明这些易形成生物膜的区域是潜在污染源。此外，大肠杆菌在奶酪布上的高丰度进一步表明，可重复使用的器具是细菌残留与再污染的重要风险点（表1和图1）。宏基因组学分析共检测到974种抗生素抗性基因（ARGs），设备样本的ARG负荷显著高于乳制品样本；按RPKM（每百万碱基读取数）标准化后统计，ARG载量最高的为奶酪罐N7（157个ARG）、搅拌器N8（146个ARG）与切割线N9（135个ARG）。这些ARG主要涉及β-内酰胺类、氨基糖苷类与四环素类抗性，其中RND型外排泵与β-内酰胺酶是主要耐药机制，见图2-图3。CAZyme功能分析显示奶酪布（N10）在糖苷水解酶（GHs）和糖基转移酶（GTs）等家族上富集，表明微生物具有较强的多糖降解与代谢活性，同时暗示其在生物膜形成和产品潜在腐败过程中的作用；而乳制品样本中CAZyme主要集中于凝乳（N3）与凝块（N4），反映发酵阶段的糖代谢活性（图4-图5）。KEGG功能注释分析进一步表明，乳制品样本主要富集于氨基酸与辅酶代谢途径，而设备样本在信号转导和能量代谢通路上的富集更显著，该富集特征与环境应激反应及耐药性相关的代谢活动增强有关（图6）。

总之，本研究以土耳其小型乳制品厂白奶酪生产为对象，创新性整合MALDI-TOF MS蛋白质组学与鸟枪法宏基因组学技术，突破传统纯培养方法局限，首次在土耳其小规模乳制品体系中实现可培养与不可培养微生物及耐药组的技术整合型综合剖析。研究揭示了设备（尤其奶酪布）是微生物污染与ARG富集的关键来源，且传统巴氏杀菌无法完全清除耐药菌，为白奶酪安全生产提供了新的科学证据。然而，本研究样本量有限，仅覆盖单一工厂，结论推广至不同规模和地区的乳制品生产仍需进一步验证。未来研究应聚焦设备清洁消毒策略的优化及耐药基因传播路径的追踪，以完善小型乳制品企业的安全生产体系。

表1  宏基因组学分析揭示的乳制品与环境样本中指示性细菌的相对丰度

图1  不同样本中鉴定物种的相对丰度与群落差异分析。（A）乳制品样本（N1–N5）与环境样本（N6–N10）中主要物种的相对丰度与分布；（B）基于物种水平的非度量多维尺度分析（NMDS），展示乳制品与设备样本的聚类差异。

图2  不同样本中ARGs的丰度分布热图 

图3  （A）采样点检测到的耐药组。内部线条连接样本与抗生素家族。（B）抗生素作用机制及其与变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）的关联。内部线条连接变形菌门和厚壁菌门与作用机制。

图4  不同样本中CAZymes的丰度分布图

图5  基于一级EggNOG数据库的同源基因簇（COG）功能分类分析。（A）各功能子系统类别的匹配基因数量分布；（B）基于一级EggNOG功能注释的主坐标分析（PCoA），黑点代表乳制品样本（D），红点代表设备样本（E）

图6  乳制品样本与环境样本的二级KEGG代谢通路热图。不同颜色表示各样本中代谢通路的相对丰度差异，用以展示乳制品与设备样本在功能代谢方面的显著差异。 

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodres.2025.117432