基于荧光染料的细菌检测策略

原创

来源：陶诗友

2025-10-30 17:10:00

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核心提示：基于荧光染料的细菌检测研究获新进展，形成四大核心策略：依托与脂多糖等细胞壁成分的作用检测细菌膜、借助硝基还原酶等细菌酶反应检测细菌、利用肽聚糖合成进行化学荧光标记，以及检测细菌内汞离子、氯离子等。

1.引言

人体内存在数百万种细菌，多数有益且在消化、维生素合成等方面发挥关键作用，但部分致病菌及抗生素滥用催生的多重耐药菌，会引发严重感染甚至致死，准确鉴定细菌菌株对感染诊疗与新抗生素研发至关重要。

致病菌分革兰氏阳性菌（细胞壁厚、肽聚糖交联度高、无外膜）与革兰氏阴性菌（肽聚糖层薄、有含脂多糖等的外膜），且细菌内多种酶与感染机制、耐药性相关。传统检测方法存在耗时、成本高、操作复杂等问题，而基于荧光染料的细菌检测技术优势显著，可实现细菌实时成像与定量分析，兼具检测与光动力抗菌功效的诊疗探针也成研究热点，本文将研究这类荧光探针的相关情况。

2.结果与讨论

探针 1-3 由吡啶𬭩功能化二苯并 [a,c] 吩嗪与不同长度烷基链（乙基、辛基、十六烷基）组成。结果显示，吡啶𬭩盐单元与带负电的脂多糖相互作用，限制荧光团自由旋转，引发聚集诱导发光，在 532 nm 左右出现最大吸收峰，水相比例增加时在 720 nm 处产生聚集诱导发光信号。其中，短乙基链的探针 1 对脂多糖的荧光增强效果最显著，检测限低至 0.26 nM，且单线态氧量子产率（70.6%）远超探针 2（30.7%）和探针 3（30.2%）。生物实验中，探针 1 在大肠杆菌（革兰氏阴性菌）中呈现强荧光，且在 530 nm 激光照射下可作为光敏剂诱导细菌光动力死亡，表明其兼具脂多糖检测与抗菌功能。

图 1：探针 1-3 的化学结构及对脂多糖的传感机制

探针 4 以聚集诱导发光分子 AIE-DCM 为荧光团，修饰两个多粘菌素 B 以特异性结合脂多糖。多粘菌素 B 与脂多糖的强相互作用抑制荧光团自由旋转，使探针在 439 nm 处有吸收，650 nm 处产生荧光。实验表明，探针 4 仅对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌等革兰氏阴性菌呈现明亮荧光，且经特定光照射后可通过光动力效应杀灭革兰氏阴性菌，为革兰氏阴性菌的特异性检测与治疗提供了工具。

图 2：探针 4 的化学结构

探针 5-7 以四苯乙烯为聚集诱导发光团，连接不同长度烷基链（n=1,4,8）的咪唑𬭩离子液体。阳离子咪唑𬭩通过静电和疏水作用与带负电细菌细胞结合，激活荧光团在 258 nm 吸收、475 nm 发射荧光。扫描电镜图像显示，随着烷基链长度增加，探针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）的成像效果及抗菌活性均增强，且能选择性检测死菌。荧光成像结果表明，探针在红细胞悬液中可清晰识别大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，且不影响红细胞活性，体现出良好的生物相容性与细菌特异性。

图 3：探针 5-7 的化学结构及应用效果

探针 8 为含硼酸基团的 BODIPY 衍生物，硼酸基团可与革兰氏阳性菌表面糖蛋白结合，通过解聚集诱导发光效应实现检测 —— 聚集状态下荧光背景低，结合革兰氏阳性菌后荧光开启。结果显示，探针 8 对发酵乳杆菌、金黄色葡萄球菌等 9 种革兰氏阳性菌均产生显著荧光，而对大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌无明显信号。在小鼠眼感染模型中，仅金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）感染眼呈现强荧光，铜绿假单胞菌（革兰氏阴性菌）感染眼荧光微弱，证实其在临床革兰氏阳性菌检测中的潜力。

图 4：探针 8 的化学结构及检测效果

探针 9-10 以萘酰亚胺为吸电子基团，分别以四苯乙烯或三苯胺为供电子基团，引入叔胺以靶向革兰氏阳性菌表面的脂磷壁酸和糖醛酸。探针 9 在 375 nm 吸收、537 nm 发射荧光，探针 10 在 430 nm 吸收、549 nm 发射荧光，水相比例升高时因聚集诱导发光效应荧光增强。共聚焦成像显示，即使在革兰氏阴性菌和真菌共存时，探针仍能选择性、高灵敏度地染色金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，为细菌革兰氏分型及诊疗应用提供了新思路。

图 5：探针 9-10 的化学结构及成像效果

探针 11（单胺）、12（二胺）、13（阳离子二胺）具有不同正电荷数。实验表明，二胺探针 12 对鲍曼不动杆菌、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌等革兰氏阴性菌呈现特异性荧光染色，单胺探针 11 无荧光活性，阳离子二胺探针 13 对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）和阴性菌均有染色效果。这一差异源于革兰氏阴性菌膜电位更负，与探针 12 的静电电荷匹配度更高。探针 12 在 375 nm 吸收、515 nm 发射荧光，且能对导尿管中革兰氏阴性菌生物膜进行成像，在医疗领域细菌检测中具有应用价值。

图 6：探针 11-13 的化学结构及检测效果

探针 14-18 以二酮吡咯并吡咯为荧光团，连接不同长度烷基链（n=3,6,8,10,12）。与大肠杆菌相互作用实验显示，短链探针 14、15 可完全进入细菌内部发光，长链探针 16-18 则主要在细菌膜上产生荧光，这与短链探针作用于双层膜单小叶、长链探针插入膜双层结构有关。对铜绿假单胞菌的抗菌实验表明，短链探针 15 能 thinning 生物膜，抗菌效果显著；长链探针 17、18 通过破坏膜结构发挥优异抗菌活性；探针 14 因单分子层相互作用、探针 15 因分子尺寸适中，均不损伤细菌膜。该结果证实分子结构与尺寸对探针抗菌效果的关键影响，为抗菌探针设计提供参考。

图 7：探针 19 的化学结构及检测机制

探针 19 利用聚集诱导发光效应选择性成像革兰氏阳性菌，在阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠存在时，650 nm 处荧光显著增强（无十二烷基硫酸钠时无荧光），动态光散射和扫描电镜证实探针与十二烷基硫酸钠形成球形纳米聚集体，激活聚集诱导发光。细菌成像显示，探针 19 仅在金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）中产生荧光，大肠杆菌（革兰氏阴性菌）中无信号，这归因于其季铵盐基团与革兰氏阳性菌细胞壁上带负电的磷壁酸及厚肽聚糖层的特异性结合，可有效区分革兰氏阳性与阴性菌。

图 8：探针 19 的化学结构及检测机制

探针 20-21 以试卤灵为荧光团，通过醚键或碳酸酯键连接对硝基苄基单元，响应硝基还原酶。无硝基还原酶和 NADH 时，探针 20 在 450 nm 有吸收但无荧光；与硝基还原酶 / NADH 反应后，564 nm 处出现新吸收峰，586 nm 处产生强荧光。在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中，探针 20 呈现明亮红色荧光，而加入硝基还原酶抑制剂双香豆素后荧光显著减弱，热灭活细菌（无硝基还原酶活性）中荧光也大幅降低，表明其可特异性检测细菌硝基还原酶活性。探针 22 以萘酰亚胺为荧光团，对硝基苄基为识别单元，检测限 3.4 ng/ml，不仅能成像大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，还可检测 HepG2、MCF-7 等缺氧癌细胞中的硝基还原酶，双香豆素处理后荧光减弱，证实其依赖硝基还原酶活性产生信号。

图 9：探针 20-22 的化学结构及检测效果

探针 23 为近红外荧光探针，由花青染料连接对硝基芳香基团，修饰新霉素以靶向细菌。硝基的吸电子作用淬灭花青染料的近红外荧光，硝基还原酶 / NADH 将硝基还原为氨基后，780 nm 吸收、801 nm 发射的近红外荧光恢复，酶反应 3 分钟内完成，检测限 0.67 ng/ml。对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）和阴沟肠杆菌（革兰氏阴性菌）的检测显示，探针 23 荧光显著增强，加入双香豆素后荧光减弱；与人类外周血单核细胞、肝癌细胞相比，细菌中荧光更明亮。体内小鼠模型中，探针 23 在细菌感染部位 30 分钟内荧光强增强，肿瘤部位无明显信号，可用于体内外细菌感染及相关疾病研究。

图 10：探针 23 的化学结构及应用效果

探针 24 为聚集诱导发光分子 - 肽偶联物，经细菌碱性磷酸酶去磷酸化后，在细菌表面形成聚集纤维结构，激活聚集诱导发光，对碱性磷酸酶检测限达 6.6×10⁻³ U/ml。细菌实验显示，探针 24 仅在高表达碱性磷酸酶的大肠杆菌中产生明亮荧光，金黄色葡萄球菌中无荧光；加入碱性磷酸酶抑制剂 L - 苯丙氨酸后，大肠杆菌中荧光急剧减弱，透射电镜观察到大肠杆菌表面形成纤维结构，证实其可选择性检测高表达碱性磷酸酶的细菌。

图 11：探针 24 的去磷酸化反应及检测效果

探针 25 由四苯乙烯连接头孢菌素组成，β- 内酰胺酶介导的 cleavage 反应使荧光开启，同时生成的 TPE-OH 作为光敏剂，光照下产生活性氧杀灭细菌。纤维捕获细菌实验表明，探针 25 对高表达 β- 内酰胺酶的耐药大肠杆菌（E. coli/pUC19）的荧光增强效果显著优于其他细菌，纤维试纸随耐药菌浓度升高呈现从蓝到绿的荧光变化，可实时检测耐药菌。扫描电镜显示，光照下探针 25 处理的耐药大肠杆菌出现收缩和融合，黑暗中无此现象，证实其兼具耐药菌检测与光动力杀灭功能。

图 12：探针 25 的 β- 内酰胺酶 cleavage 反应

探针 26 以头孢菌素为 β- 内酰胺酶识别单元，海藻糖为 Ag85s 靶向基团，β- 内酰胺酶水解头孢菌素的内酰胺环，生成高荧光的呫吨衍生物探针 27，通过 Ag85s 介导的海藻糖途径标记细菌细胞壁。共聚焦成像显示，探针 26 仅对耻垢分枝杆菌（表达 β- 内酰胺酶的放线菌）产生强荧光，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等无信号；探针 27 对白喉棒状杆菌（放线菌，无 β- 内酰胺酶）和耻垢分枝杆菌均有强荧光。巨噬细胞内卡介苗成像实验中，探针 26 处理的卡介苗呈现绿色荧光，与 TAMRA-Tre 标记的红色荧光重叠，探针 27 无荧光，表明其可可视化巨噬细胞内的卡介苗。

图 13：探针 26-27 的化学结构及成像效果

探针 28 为半胱天冬酶 - 1 响应的聚集诱导发光分子 - 肽偶联物，巨噬细胞感染细菌后激活半胱天冬酶 - 1， cleavage 探针使聚集诱导发光分子残基自组装并在细菌吞噬体中聚集，开启荧光，且残基作为光敏剂光照下产生活性氧。实验显示，探针 28 仅在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌感染的巨噬细胞中产生聚集诱导发光荧光，未感染巨噬细胞中无信号；Hoechst 染色（标记 DNA）显示荧光与细菌吞噬体重叠，活性氧指示剂 DCF-DA 的绿色荧光也与吞噬体重叠，表明聚集诱导发光残基在吞噬体中聚集并产生活性氧。菌落计数实验表明，光照下探针 28 浓度依赖性降低巨噬细胞内金黄色葡萄球菌存活数；体内实验中，探针 28 可对小鼠感染部位进行荧光成像，光照后感染部位菌落数显著减少，实现细菌感染检测与光动力治疗的结合。

图 14：探针 28 的化学结构及诊疗效果

探针 29-32 分别以羟基香豆素、硝基苯并呋喃、荧光素、四甲基罗丹明为荧光团，修饰 D - 丙氨酸或 D - 赖氨酸。D - 氨基酸参与肽聚糖合成并整合到肽聚糖肽链中，通过酶催化周质交换反应标记肽聚糖合成活性位点。探针 29-32 的最大发射波长分别为 450、538、515、565 nm，时间序列成像显示，探针 30 标记的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 ΔdacA 细胞中，荧光信号在细菌极帽处保留，在侧壁逐渐消失，与细菌侧壁沿长度方向生长的报道一致。三重标记实验中，不同荧光颜色的探针清晰指示各时期肽聚糖合成的位置与强度，可追踪细菌肽聚糖合成的时间动态。

图 15：探针 29-32 的化学结构及应用效果

探针 33 为转子荧光型 D - 赖氨酸探针，氰基丙烯酸单元作为扭曲分子内电荷转移荧光团，D - 赖氨酸整合到肽聚糖肽链后，470 nm 激发下 640 nm 处发射荧光。与背景荧光强的荧光 D - 氨基酸 HADA 相比，探针 33 因 “关 - 开” 荧光响应无需洗涤步骤即可成像，其 L - 对映体探针 34 无荧光，证实荧光源于 D - 氨基酸参与的肽聚糖转肽反应。探针 33 可实时可视化细菌肽聚糖合成（新形成的细胞分支和分裂隔膜呈红色荧光），头孢西丁（抑制转肽酶，阻断肽聚糖合成）处理后无荧光，氯霉素（无肽聚糖合成抑制作用）处理后荧光增强，可用于转肽酶活性实时检测。探针 35 以聚集诱导发光光敏剂修饰 D - 丙氨酸，D - 丙氨酸结合细菌壁后激活聚集诱导发光，水溶性好、尺寸小，可穿透耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的巨噬细胞和生物膜，光照下产生单线态氧杀灭细菌，体内可成像小鼠感染部位，光照后感染组织菌落数减少、炎症浸润减轻，兼具细菌靶向诊断与光动力治疗功能。

图 16：探针 33-35 的化学结构及检测机制

探针 36 以香豆素衍生物为荧光团，含邻苯二胺和 1,3 - 二硫杂环戊烷单元，与汞离子反应时，1,3 - 二硫杂环戊烷转化为甲酰基并发生分子内环化，导致比率荧光变化，检测限 27 nM。在大肠杆菌中，随汞离子浓度升高，红色通道荧光增强，绿色通道荧光减弱，可追踪细菌内汞离子，为研究细菌中汞离子的生物转化提供工具。

图 17：探针 36 的化学结构及汞离子传感机制

探针 37 为半互穿聚合物网络荧光水凝胶，由亲水性聚（N - 羟乙基丙烯酰胺）网络和荧光共聚物 PA-NDBCB 组成；探针 38 为聚（羟乙基丙烯酸酯）水凝胶（对照）。无汞离子时，探针 37 在 510 nm 发射绿色荧光；与汞离子反应后，萘酰亚胺衍生物发生脱硫 / 环化反应，365 nm 激发下 425 nm 处产生蓝移荧光，检测限 0.067 µM。聚（N - 羟乙基丙烯酰胺）具有抗污性，可抑制细菌粘附，因此探针 37 与大肠杆菌共培养 48 小时后荧光发射稳定，而探针 38 荧光强度降低。此外，探针 37 可增强污染水和食品样品中汞离子的荧光信号，适用于细菌环境中汞离子的长期比率检测。

图 18：探针 37-38 的水凝胶成分及检测效果

探针 39-40 基于氯离子泵视紫红质突变体，视紫红质由视黄醛席夫碱发色团与七 α- 螺旋组成（图 20A），将天冬氨酸（D121）突变为缬氨酸（D121V）后，荧光质子泵视紫红质（wtGR）转化为荧光氯离子传感器（GR1）（图 20B）。无氯离子时，探针 39-40 在 390 nm 激发下，425-560 nm 处产生氯离子不敏感的青色荧光蛋白荧光；有氯离子时，氯离子结合 GR1 提高视黄醛席夫碱的 pKa，促使平衡向质子化状态转移，探针 39 处理的大肠杆菌在 530 nm 激发下，600-800 nm 处 GR1 荧光增强，探针 40 无明显荧光变化，检测限 12.5 mM。醋酸钠缓冲液或葡萄糖酸钠可逆转探针 39 的荧光响应，证实其能检测活大肠杆菌中氯离子的动态变化。

图 19：视紫红质结构及探针 39-40 的检测效果

2.结果与讨论

本文基于荧光染料的细菌检测技术最新进展，有机荧光探针以 “关 - 开” 荧光变化，克服传统方法缺陷，实现细菌快速、高特异、高灵敏检测，部分还兼具光动力抗菌功能，为感染诊疗提供新工具。

检测分四类策略：一是依与细胞壁成分（脂多糖、糖蛋白等）的特异作用，靶向检测细菌膜并分型，如探针 1、4、8 可区分革兰氏阴 / 阳性菌；二是借细菌酶（硝基还原酶、β- 内酰胺酶等）特异反应，检测细菌及耐药菌，如探针 20、25 能检测并杀灭耐药菌；三是用 D - 氨基酸参与肽聚糖合成，荧光标记细菌以监测其合成与生长，如探针 29、33 助力细菌生理研究；四是检测细菌内汞离子、氯离子等，支撑细菌与环境相互作用及生理机制研究，如探针 36、39 可追踪离子变化。