Cas12aCis-cleavage介导的侧向流动测定法实现多重和超特异性核酸检测

1.引言

CRISPR技术因设计简单、检测高效等优势，在核酸检测领域潜力显著，尤其在新冠疫情中推动了相关诊断技术发展。但现有CRISPR诊断技术依赖无差别反式切割机制，存在两大瓶颈：一是难以实现单管多重检测，无法满足临床多靶标检测需求，且现有multiplex方案需复杂芯片或缺乏正交切割能力；二是反式切割易受错配靶标触发，难以区分高相似序列，无法实现单碱基分辨率检测。为此，研究基于Cas12a顺式切割与侵入杂交的“双钥匙”机制，开发cc-LFA方法以突破上述局限。

在本研究中，为解决现有CRISPR诊断技术的不足，研究团队致力于开发基于CRISPR-Cas12a的诊断平台。已知CRISPR-Cas12a的顺式与反式切割机制已被充分阐明，其识别双链DNA时，先通过crRNA介导搜索PAM序列，确认DNA原间隔子与crRNA配对后，会依次发生DNA解旋、非靶标与靶标链的顺式切割及反式切割活性激活，且顺式切割发生在PAM远端，能促使带短粘性末端的PAM远端DNA产物快速分离。基于此，研究团队构建“双钥匙”识别机制——以CRISPR-Cas12a顺式切割为第一道关卡，释放的粘性末端DNA产物的侵入性杂交识别为第二道关卡，再整合多重PCR扩增与侧向流动检测平台，开发出Cas12a顺式切割介导的侧向流动测定法（cc-LFA）。该方法具备单碱基分辨率的优异特异性，不仅能高特异性检测多种呼吸道病原体样本，还可用于人乳头瘤病毒（HPV）分型检测，灵敏度超90%、特异性达100%；同时，配套开发的便携式设备可自动化完成核酸扩增与条带检测，为cc-LFA在未来分散式实验室场景的应用奠定基础。

2.结果

利用双键识别机制实现高特异性和多重CRISPR核酸检测：研究以CRISPR-Cas12a顺式切割（首道关卡）与粘性末端DNA侵入杂交（次道关卡）构建“双钥匙”机制，结合多重PCR扩增与侧流检测，开发cc-LFA。其具单碱基分辨率，可高特异性检测多呼吸道病原体及9种高危HPV亚型，灵敏度超90%、特异性100%。

图1.a：传统Cas12a跨切核酸检测方案的示意图。基于跨切机制的常规Cas12a核酸检测在实现多重检测格式时面临挑战，无论是使用荧光检测还是条带检测方法。常规Cas12a核酸检测也存在特异性问题，因为跨切活性并不严格依赖于完美的crRNA-靶标DNA配对。PAM远端DNA碱基通常对跨切表现出低特异性。b：基于Cas12a顺切核酸检测方案。在该检测方案中，靶标DNA首先通过Cas12a顺切进行检测，然后释放的具有粘性末端的PAM远端DNA产物通过入侵杂交进一步识别。这种检测原理包含两个检测关卡，使其具有高度特异性。此外，入侵杂交将靶标识别扩展至crRNA识别区域之外，进一步增强了特异性。通过设计多个crRNA和入侵探针，可以基于这种双键识别机制实现高度特异性和多重核酸检测。

释放的Cas12a顺式切割产物可以通过入侵杂交进行高特异性识别：研究先以ASFVDNA为靶标，证实Cas12a顺式切割会生成带6bp粘性末端的PAM远端DNA产物，且该产物受Trans切割影响小、能保留粘性结构。后续实验表明，5bp及以上粘性末端可高效介导入侵杂交，且该杂交对探针碱基突变敏感，尤其中间区域，故释放的顺式切割产物能通过入侵杂交实现高特异性识别。

图2.a：LbCas12a顺式切割介导了粘性末端DNA产物的生成。以ASFVDNA序列为靶标，测序结果表明顺式切割产物包含一个6碱基的粘性末端。b：5′-过伸双链DNA不是LbCas12a转式切割的优先底物。荧光实验表明ssDNA底物的切割效率远高于5′-过伸双链DNA。条形图的收集时间为20分钟。c：使用荧光标记的5′-过伸双链DNA底物和ssDNA入侵探针验证入侵杂交。5′-过伸双链DNA包含一个5碱基的粘性末端。荧光实验显示入侵杂交触发淬灭基团标记DNA的位移，导致荧光显著增强。d,e：通过荧光实验评估入侵杂交的序列依赖性。入侵DNA探针包含单碱基或双碱基突变，覆盖所有位置。将荧光强度与完全匹配的入侵探针杂交进行比较。数据以平均值±标准差（n=3，独立重复实验）的形式呈现于（b、d和e）中，误差线代表标准差。a.u.代表任意单位。源数据以源数据文件提供。

开发cc-LFA平台：研究整合Cas12a顺式切割与侵入杂交的“双钥匙”机制、多重PCR及侧流检测，开发cc-LFA平台。选PCR扩增，LbCas12a顺式切割生物素化扩增子，产物与金纳米颗粒-DNA探针杂交后经侧流条检测，“一步法”10分钟完成反应，对ASFV质粒DNA检测限达14.2拷贝/反应。

图3.a：电化学侧流层析法是一种无需光学检测仪器的核酸检测技术。核酸靶标通过生物素标记的引物扩增，随后进行Cas12a顺式切割和AuNP-DNA探针入侵杂交，最终被条带捕获进行显色。b：验证cc-LFA概念的反应组分缺失实验。右图显示了测试线和控制线的显色结果及强度定量。c：三种cc-LFA检测模式的示意图。在操作模式1中，金纳米探针预先固定在结合垫上。在37°C反应10分钟后，含有扩增靶标产物的CRISPR系统被添加到结合垫上进行室温下10分钟的链入侵反应，然后进行侧流层析。在操作模式2中，金纳米探针在顺式切割后加入CRISPR系统，随后在室温下孵育10分钟，然后进行侧流层析。操作模式3，将扩增的目标产物、CRISPR反应系统和金纳米粒子探针置于同一管中，在37°C下孵育10分钟后直接进行侧向流动测定。d：在三种cc-LFA测试模式下获得的检测结果。e：展示了所有一体化操作模式3在不同反应时间下的检测结果。f：通过检测非洲猪瘟病毒DNA的不同浓度来评估cc-LFA的分析灵敏度。虚线表示检测限，其由NTC的强度加上三倍的标准差确定。在(d,e和f)中，数据以平均值±SD(n=3,独立重复)表示，误差线代表SD。对于f，使用双尾t检验进行统计分析。统计显著性表示如下：n.s.=无显著性，P>0.05，以及星号(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001)。准确的P值列在相应的误差线上方。NTC代表非模板对照。使用ImageJ软件提取测试线强度。a.u.代表任意单位。源数据以源数据文件的形式提供。

采用双重钥匙检测机制的cc-LFA预计将具有超特异性：为验证cc-LFA的超特异性，研究通过在crRNA、入侵探针引入碱基突变，发现多数突变位点检测信号显著减弱甚至消失；其对单/双碱基突变目标检测灵敏度高，优于三种主流CRISPR诊断技术，还能在高浓度野生型DNA背景下精准检测单碱基突变EGFR（L858R），凸显超特异性。

图4.a和b展示了LbCas12acrRNA及其配对靶标。测试的靶标包括完全匹配的序列以及在不同位置具有2个连续碱基突变或单个碱基突变的序列。c：cc-LFA平台适用于检测两碱基错配序列（d）和单碱基错配序列（e）。f：基于Cas12a跨切分的侧向层析法适用于检测两碱基错配序列（g）和单碱基错配序列（h）。i：基于Cas12a跨切分的荧光法适用于检测两碱基错配序列（j）和单碱基错配序列（k）。l：基于Cas9的CASLFA平台适用于检测两碱基错配序列（m）和单碱基错配序列（n）。上述四种方法中使用的完整配对、单碱基突变或两碱基突变靶标相同，均为桥式PCR产物。数据以平均值±标准差（n=3，独立重复实验）表示，误差线代表标准差。使用ImageJ软件提取测试线强度。PM代表完全匹配序列。a.u.代表任意单位。源数据以源数据文件提供。

cc-LFA是一种可扩展的多重核酸检测平台：cc-LFA 可扩展为多重核酸检测平台：先构建双基因、三基因平台检测呼吸道病原体（SARS-CoV-2、IAV、IBV），再拓展至 9 种高危 HPV 亚型分型，均无交叉干扰；临床检测中，对 Ct 值 < 35 样本灵敏度、特异性达 100%，Ct 值 < 38 时灵敏度仍超 90%，展现良好可扩展性。

图5.a：基于cc-LFA的双基因检测SARS-CoV-2RNA。b：基于双基因cc-LFA的三种典型测试情况。下方面板也显示了测试线强度的定量结果。c：基于双基因cc-LFA检测SARS-CoV-2RNA的分析灵敏度和特异性评估。数据以平均值±标准差（n=3，独立重复实验）表示，误差线代表标准差。NTC代表无模板对照。对于c，统计分析采用双尾t检验。统计显著性表示如下：n.s.=无显著性（P>0.05），以及星号（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001）。相应的误差线上方列出了准确的P值，O基因在上方，N基因在下方。a.u.代表任意单位。d：采用双基因cc-LFA检测45例临床SARS-CoV-2样本。这些临床样本通过CFDA批准的RT-qPCR试剂盒确认，并相应列出了其Ct值。e：基于检测Ct值低于35和38的样本，分别说明敏感性性能。f：开发用于同时检测三种呼吸道病原体的cc-LFA。g：基于三基因cc-LFA的典型8种测试情况。下方面板也显示了测试线强度的定量结果。h：采用三基因cc-LFA检测112例临床呼吸道疾病样本。这些临床样本使用CFDA批准的RT-qPCR试剂盒进行确认，并相应列出了其Ct值。基于检测Ct值低于35和38的样本，分别陈述了检测IBV(i)、IAV(j)和SARS-CoV-2(k)的敏感性性能。源数据以SourceData文件形式提供。

图6.a：正交实验分析用于评估针对9种高危HPV亚型的crRNA和入侵探针的特异性。所使用的靶标均为生物素标记的PCR产物。b：正交实验分析用于评估基于Cas12a跨切割的荧光检测法对9种高危HPV亚型的鉴定特异性。c：九基因cc-LFA平台检测高危HPV亚型的方案。d：九基因cc-LFA检测了单个HPV亚型和四种多重HPV亚型的组合。#4代表HPV16、18、31和33。#5代表HPV16、11、18、31和33。#7代表HPV16、11、6、18、31、33和58。#9代表HPV16、11、6、18、31、33、45、52和58。具体而言，T1线检测的HPV-16是生物素标记的PCR扩增产物，而其余八条T线分别检测其他八个HPV亚型，每个亚型由含有C3间隔修饰的条形码序列的PCR产物表示。e：九基因cc-LFA检测了32例潜在的HPV感染临床样本。这些样本通过临床采用的PCR试剂确认。f敏感性及特异性分析。NTC代表非模板对照。源数据以源数据文件的形式提供。

开发便携式cc-LFA设备：研究设计制造了紧凑型便携式 cc-LFA 设备（86mm×149mm×135mm），可自动完成 PCR、Cas12a 顺式切割及侧流检测。设备通过薄膜储液、推杆控液与温控模块实现全流程自动化，对 HPV16 DNA 检测限达 20 拷贝，检测 50 份临床样本与 qPCR 结果高度一致（AUC=0.9872），适配分散式检测场景。

图7.a：可移动设备的外部渲染图，尺寸为86毫米×149毫米×135毫米（长×宽×高）。b：可移动设备的内部结构图和薄膜样本垫的结构。c：设备的内部工作流程。d：使用可移动设备进行核酸检测的操作过程。e：使用200000、20000、2000、200、20、2拷贝的HPV16DNA作为模板测试POC设备的检测限。f：不同拷贝数下测试结果的定量分析。虚线表示检测限，由NTC强度加上三倍标准差确定。数据以平均值±标准差（n=3，独立重复实验）表示，误差线代表标准差。对于f，使用双尾t检验进行统计分析。统计显著性表示如下：n.s.=无显著性（P>0.05），以及星号（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001）。精确的P值列在相应的误差线上方。NTC代表非模板对照。使用ImageJ软件提取测试线强度。a.u.代表任意单位。g：50份临床样本用于评估便携式设备的检测性能，其中包括2份同时感染HPV16和HPV18的样本。黄色方块表示便携式设备识别的HPV16阳性样本，蓝色方块表示便携式设备识别的HPV18阳性样本，灰色方块表示qPCR识别的阳性样本，白色方块表示阴性样本。Ct值为34.04的样本26未被检测到。h：对POC设备检测的50份临床样本结果进行了受试者工作特征（ROC）分析，AUC值为0.9872。源数据以源数据文件形式提供。

3.总结

本研究开发了基于 CRISPR-Cas12a 顺式切割介导的侧向流动检测法（cc-LFA），用于高特异性多重核酸检测。该平台依托 “双钥匙” 识别机制（Cas12a 顺式切割 + 粘性末端 DNA 侵入杂交），结合多重 PCR 扩增，实现单碱基分辨率检测，抗高浓度野生型 DNA 干扰。在优化条件下，cc-LFA 表现出优异分析性能，对多种呼吸道病原体检测灵敏度超 90%、HPV 分型检测特异性达 100%。此外，配套开发低成本便携式自动化设备，可完成核酸扩增至条带检测全流程，在临床样本检测中与 qPCR 结果高度一致（AUC=0.9872）。该技术在玉米粉和小麦粉实际样品中对这些霉菌毒素的检测取得了令人满意的结果，且所报道的方法符合动物饲料和食品的分析监管限值，为分散式场景下的核酸诊断提供更简单、低成本的替代方案，适用于呼吸道病原体筛查与高危 HPV 分型等临床需求。

论文链接： https://doi.org/10.1038/s41467-025-60917-9