革命性空气细菌检测突破：比色法实现物种特异性高灵敏定量

空气传播细菌（生物气溶胶）是影响室内空气质量的关键因素，某些细菌物种如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）可引发呼吸道感染、皮肤疾病甚至急性肺损伤，对公共卫生、食品工业和医疗环境构成严重威胁。例如，家庭环境中金黄色葡萄球菌的浓度范围为4-140 CFU/m³，而学校环境中大肠杆菌的浓度可达28.26-60.07 CFU/m³。目前，物种特异性检测主要依赖免疫学方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA），其虽具有高灵敏度，但操作复杂、耗时较长（需4-6小时），且洗涤步骤易导致假阳性或灵敏度下降。此外，传统方法受实验者技能影响较大，难以满足现场快速监测需求。因此，开发一种简单、快速且高灵敏的检测技术至关重要。本研究基于抗原-抗体反应与过滤原理，结合辣根过氧化物酶（HRP）信号放大，提出了一种新型比色检测方法，旨在解决现有技术的局限性，为空气细菌监测提供创新解决方案。

研究成果

1. 方法原理与设计​​

本研究的核心创新在于将过滤技术与酶催化反应相结合，通过测量游离抗体浓度间接定量细菌。方法流程（如Figure 1所示）包括：将HRP标记的抗体（Ab@HRP）与细菌溶液混合，形成细菌-Ab@HRP复合物；利用孔径0.22μm的滤膜捕获复合物，而游离Ab@HRP穿透滤膜；随后，滤液中的HRP催化TMB底物产生颜色变化（蓝色氧化TMB在加入停止液后变为黄色），通过测量450nm波长吸光度值，实现细菌浓度定量。吸光度与细菌浓度呈负相关，即细菌越多，游离抗体越少，吸光度越低。该方法无需复杂洗涤，总耗时仅25分钟，显著提升了操作效率。

Figure 1  基于抗原-抗体反应和过滤的比色细菌检测方法示意图。

2. 液体样本检测性能

在液体样本测试中（如Figure 2所示），方法对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出高灵敏度。吸光度值与细菌浓度（CFU/mL）呈负相关线性趋势：大肠杆菌的检测限（LOD）为21.5 CFU/mL，金黄色葡萄球菌为246 CFU/mL。这一结果优于同类过滤比色方法（如金纳米颗粒标记法的LOD为1500 CFU/mL），并与近期传感器研究相当（如荧光适体传感器为270 CFU/mL）。线性响应范围覆盖10^0至10^5 CFU/mL，验证了方法在宽浓度范围内的可靠性。

Figure 2  使用所提出的方法测得的液体样品中不同细菌浓度的吸光度值，这些液体样品来自细菌储备液：(A) 大肠杆菌 (E. coli) 和 (B) 金黄色葡萄球菌 (S. aureus)。测量进行了三次重复，所有报告的数值均表示平均值 ± 标准差；n = 3 次重复测试。

3. 空气样本验证与应用

通过气溶胶生成和空气-液体采样（SKC BioSampler），方法成功应用于空气中细菌的定量。液体样本中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的LOD分别为81.8 CFU/mL和143 CFU/mL，换算为空气浓度后，LOD分别为545 CFU/m³和953 CFU/m³（如Figure 3所示）。虽然该值高于真实环境浓度（如家庭中金黄色葡萄球菌为4-140 CFU/m³），但通过提高采样富集比（如使用静电采样器可达1,500,000）可进一步降低LOD。实验还发现，革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）在采样过程中易受机械损伤，导致尺寸减小46.7%，而革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）仅减少14.5%，这影响了检测灵敏度，凸显了采样优化的重要性。

Figure 3  通过空气到液体的细菌气溶胶采样获得的液体样品中的细菌浓度：（A）大肠杆菌，（B）金黄色葡萄球菌。测量进行了三次重复，所有报告的数值均为平均值 ± 标准差；n = 3 次重复测试。

4. 物种特异性测试

方法对目标细菌表现出高度特异性。在非目标细菌（如 Bacillus cereus 和 Staphylococcus epidermidis）测试中，吸光度值显著高于目标细菌，且混合样本中仍能准确识别目标物种（如Figure 4所示）。尽管金黄色葡萄球菌表达的蛋白A可能与非特异性IgG结合，但吸光度始终高于LOD阈值，证明方法可有效避免交叉反应。

Figure 4  拟议检测方法的特异性研究。(A) 示意图。(B) 抗大肠杆菌抗体@HRP 和 (C) 抗金黄色葡萄球菌抗体@HRP 对各种细菌株的特异性：大肠杆菌 4.56 × 10³ CFU·mL−1，金黄色葡萄球菌 3.02 × 10³ CFU·mL−1，蜡状芽孢杆菌 1.31 × 10⁴ CFU·mL−1，表皮葡萄球菌 5.37 × 10⁴ CFU·mL−1。测量进行了三次重复，所有报告值均为平均值 ± 标准差；n = 3 次重复测试。

5. 检测灵敏度优化策略

通过调控Ab@HRP浓度可进一步降低LOD。当抗体浓度从1000 ng/mL降至40 ng/mL时，剂量响应曲线斜率增加，LOD显著改善（如Figure 5所示）。此外，使用高亲和力抗体或信号放大系统（如生物素-链霉亲和素）可提升灵敏度，为低浓度样本检测提供路径。

Figure 5  Ab@HRP浓度对所提方法检测限（LOD）的影响。(A, B) 在三种Ab@HRP浓度（1000、200和40 ng·mL−1）下，E. coli和S. aureus的剂量–反应曲线。测量进行了三次重复，所有报告的数值均为平均值±标准差；n=3次重复测试。(C) 示意图显示了剂量–反应曲线的形状如何随着Ab@HRP浓度变化。案例4代表最高浓度，其浓度依次递减为案例3 → 2 → 1。

本研究成功开发了一种基于过滤的比色检测方法，实现了空气中细菌的物种特异性、高灵敏定量检测。方法通过优化抗原-抗体反应条件（如液体中反应避免变性）、结合HRP信号放大和过滤技术，显著提升了检测性能（LOD低至545 CFU/m³），并克服了传统ELISA的操作复杂性和灵敏度不足问题。环境意义方面，该方法为公共卫生、食品工业和医疗环境的空气质量管理提供了实用工具，尤其适用于现场快速监测，有助于降低病原体传播风险。然而，当前LOD仍高于真实环境浓度，未来需通过提高采样富集比（如采用静电采样器）、使用高亲和力抗体或信号放大策略进一步优化。此外，细菌在采样过程中的损伤（尤其是革兰氏阴性菌）提示需改进采样技术以保持细菌完整性。总体而言，该方法以其快速、简便和低成本优势，为细菌监测领域带来了创新突破，但进一步研究应聚焦于实时检测集成和多物种同步检测能力的扩展，以应对复杂环境挑战。

原文doi：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2025.138761