革命性败血症诊断突破：2小时无培养细菌检测改变游戏规则

败血症是一种危及生命的全身性感染反应，每年全球约5000万人患病，导致1300万人死亡，患者生存率每小时延迟治疗下降8%。其中25-30%的败血症病例涉及血流感染，快速检测和识别血液中病原体对及时启用有效抗生素治疗至关重要。然而，当前临床标准方法依赖血培养，需要数小时至数天才能获得结果，导致医生往往在诊断前经验性使用广谱抗生素，这不仅增加抗生素耐药性风险，还可能引起肝毒性等副作用。现有技术如PCR虽能快速识别细菌但无法提供药敏信息，而质谱方法需要较高细菌载量。更严重的是，血流感染中细菌浓度极低（1-10 CFU/ml），尤其对儿科患者，大样本量采集困难。因此，开发一种快速、高灵敏度、无需预培养的检测方法成为迫切临床需求。本研究针对这一挑战，创新性地结合物理分离、微流控技术和人工智能，旨在实现败血症的早期精准诊断。

1. 智能离心技术实现高效细菌分离

本研究首先通过智能离心步骤从全血中高效分离细菌。该方法通过优化密度介质（淋巴Prep与血培养培养基混合）和离心参数（5分钟，600xg），在稀释血样上层形成高密度层，利用细菌与血细胞沉降速度差异（细菌斯托克斯速度约为血细胞的1/30），实现细菌选择性富集于上清液。实验结果显示，该方法能去除99.82%的红细胞、95%的白细胞和63%的血小板，同时对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌的回收率分别达65%、95%和64%，显著优于传统离心（34%回收率）。这一步骤为下游处理奠定了低背景、高细菌浓度的基础（如Figure 1所示）。

Figure 1 液体和细胞运动的示意图。左右两侧的试管说明了样品液体、密度介质、红细胞和细菌在智能离心前后的分布位置。中间的图定性地展示了离心过程中细菌（绿色）和红细胞（红色）的轨迹（实线），从混合状态（左括号）到分离状态（右括号）。

2. 集成化工作流程确保快速处理

整个检测流程设计为五个核心步骤：智能离心、选择性血细胞裂解（使用胆酸钠和皂苷混合液，10分钟孵育完全裂解残留血细胞）、体积减少（通过二次离心沉淀细菌至0.5ml）、微流控捕获与显微镜成像、深度学习检测（如Figure 2所示）。这种流水线操作总耗时小于2小时，其中手动操作时间仅约10分钟，大幅提升检测效率。工作流程的集成化设计确保了样本在处理过程中细菌活性保持，为后续分析提供可靠输入。

Figure 2  1 使用智能离心进行分离；2 选择性血细胞裂解；3 体积缩减；4 微流控捕获和显微成像；5 基于深度学习的细菌检测。BCM 是血液培养基。

3. 微流控陷阱实现单细菌水平捕获与实时监测

微流控芯片采用交叉流过滤设计，包含8000个微型陷阱（尺寸50×1.25×1.25μm），末端设300nm限制结构防止细菌逃逸。样本在1000mbar压力下加载70分钟，30%样本流过陷阱，细菌被捕获后可在陷阱内分裂生长，形成微型培养室。通过相位对比显微镜或荧光显微镜（对荧光标记菌株）进行时间推移成像，每10分钟捕获一帧，持续90分钟。实验证实，该方法能成功捕获大肠杆菌（检测限9 CFU/ml）、肺炎克雷伯菌（7 CFU/ml）和粪肠球菌（32 CFU/ml），陷阱效率达29%，整体检测率5-44%（如Figure 3所示）。

Figure 3  a 整体测定性能，其中点表示在 2.25 ml 血液样本中检测到的阳性微捕获器数量 N，对应于不同的细菌浓度 C，线条表示最小二乘拟合的线性校准曲线 N = η ⋅ C。每个点对应一次独立实验。总共测试了 n = 12 个样本。b 单个微捕获器中细菌捕获与生长的时间-lapse 图像，显示在样本添加 40 分钟后捕获 một 个克雷伯氏肺炎菌 (K. pneumoniae) 的细菌，随后进行细菌细胞分裂。该图使用 Microsoft Excel 创建，并使用开源软件 Inkscape 编辑和组装。

4. 深度学习模型实现高精度自动识别

针对显微镜图像序列，研究训练了多种深度学习模型（包括ResNet 18、EfficientNet B2、DinoV2和Video ResNet R(2+1)D），将细菌检测定义为视频分类任务（如Figure 4所示）。模型在包含数万条时间推移图像的数据集上训练，DinoV2表现最佳，在70分钟时F1分数达93.1%，精确度和召回率均超过90%。模型能有效区分细菌生长与杂质，在阴性对照实验中无假阳性，且推理速度快（单陷阱1-3毫秒），适合实时应用。这一技术突破了传统人工判读的瓶颈，实现全自动、高吞吐量检测。

Figure 4 a 使用下采样数据评估网络，在增加的帧数上进行测试（每帧对应10分钟）。热图显示DinoV2的F1分数。b 所有模型在全分辨率下随时间的精确率、召回率、AUC（曲线下面积）和F1分数，对应于a部分的红色虚线矩形。曲线表示均值，阴影区域表示30次重新训练的标准差。c DinoV2模型的混淆矩阵、性能指标及ROC（受试者工作特性）曲线，该模型在30次重新训练中具有中位AUC分数，在全分辨率下于最终时间（70分钟）进行评估。该图使用开源软件Inkscape和Python绘图库Matplotlib创建。

本研究成功开发了一种创新的无培养细菌检测方法，通过智能离心、微流控捕获和深度学习集成，在2小时内实现血流感染的快速诊断。方法检测限低至9 CFU/ml，覆盖大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌等常见病原体（占欧盟血流感染病例20%、日本35%），显著优于传统血培养的数天周期。核心优势包括：高效率细菌分离（智能离心回收率最高95%）、最小化样本稀释（体积减少至0.5ml）、实时单细菌水平监测（微流控陷阱）和自动化分析（深度学习F1分数93.1%）。局限性主要体现在对金黄色葡萄球菌检测效率低（仅8%），推测因其分泌凝固酶引发血凝块包裹细菌所致；未来需探索纤维蛋白溶解剂改善。此外，整体检测率5-44%存在假阴性风险，可通过增加处理血体积（如10ml）或引入2-3小时预富集步骤优化。该方法操作简便（手动时间10分钟），兼容标准实验室设备，易于临床转化。未来工作应聚焦临床验证、扩展物种鉴定和集成表型药敏测试（如单细胞水平AST），同时通过机器人自动化进一步减少操作时间。本研究为败血症诊断提供了突破性工具，有望推动精准抗生素治疗，降低死亡率及抗生素滥用风险。

原文doi: https://doi.org/10.1038/s41746-025-01948-w