Journal of Advanced Research：通过基于IgY的免疫磁分离和基于噬菌体裂解酶LysGH15的胶体金免疫层析检测金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）是全球最普遍的病原体之一。每年可能发生数十万至数百万例严重侵袭性金黄色葡萄球菌感染，导致从轻度至重度皮肤感染到致命性肺炎和败血症等多种疾病。然而，传统用于诊断金黄色葡萄球菌的方法，如细菌培养、酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链反应（PCR），因检测时间长和多步骤操作而受到限制。因此，使用可靠和有效的方法来检测金黄色葡萄球菌对于诊断和预防疾病至关重要。

胶体金免疫层析试验（GICA）因其多种优势广泛应用于临床诊断，如节省时间、易于操作且可按需使用。目前，大多数成熟的GICA应用依赖于传统的捕获分子，如抗体，以实现快速病原体检测。然而，由于抗体的高成本和生产周期长，进一步的发展受到限制。

溶菌酶（lysin）是一类由噬菌体编码的细胞壁水解酶，能够特异性结合并裂解细菌。噬菌体溶菌酶以及噬菌体衍生的尾丝蛋白（TFPs）已被用作新型传感元件，用于检测多种病原体，因其对目标细菌表现出高度特异性。因此，这些蛋白可能适合用作GICA中抗体替代的捕获组分。然而，GICA检测灵敏度的局限性以及检测过程中的基质干扰仍然限制了该方法的实际应用。

免疫磁性分离（IMS）是一种技术，涉及免疫磁性微球（IMBs），这些微球是通过将特定抗体与经过特殊化学基团修饰的磁性纳米粒子结合而产生的。IMS通常在细菌检测之前使用，因为它能够从复杂的样本中捕获和分离特定的细菌。其检测灵敏度良好，并且此方法加速了目标细菌的分离和富集。因此，IMS可以与GICA结合使用，以进一步提高检测灵敏度。

 本研究采用仅具结合活性而无溶菌活性的突变蛋白LysGH15-C54A作为检测线（T线），在免疫磁分离结合分析（GICA）中特异性识别金黄色葡萄球菌。同时，以鸡抗蛋白A IgY作为金黄色葡萄球菌的特异性识别元件，在免疫磁分离（IMS）中排除其他葡萄球菌属成员，进一步提升检测灵敏度。基于IMS与GICA联用技术，本研究成功开发了一种快速、高灵敏度和特异性的金黄色葡萄球菌检测方法，并对该方法在临床样本中的性能进行了评估。

图1 金葡菌检测的IMBs-GICA方法的示意图。（A）基于IMBs的金黄色葡萄球菌的选择和富集图示。（B）基于LysGH15-C54A的GICA试条原理图。（C）结果的判定。

首先，进行了金黄色葡萄球菌IMBs捕获系统的优化。为了产生最佳的富集效果，优化了IMBs捕获系统针对金黄色葡萄球菌的反应条件。如图2A所示，当添加到每毫克MBs的鸡抗蛋白A IgY量超过40 lg时，IMBs的耦合率降低，这表明抗体已充分结合到MBs上。图2B显示了在制备IMBs后确定用于捕获金黄色葡萄球菌的IMBs量。统计分析表明，400 lg的IMBs的富集效率显著高于低于400 lg的浓度。研究人员没有发现400 lg的IMBs与超过400 lg的IMBs的富集效率之间存在显著差异。因此，400 lg的IMB足以提供足够的识别金黄色葡萄球菌的位点。

图2C显示，当IMBs与金黄色葡萄球菌的孵育时间为15分钟时，捕获效率超过98%。通过使用金黄色葡萄球菌的多次稀释，研究了制备的IMBs的敏感性。IMBs的捕获效率范围从83.67%至95.70%，当金黄色葡萄球菌的浓度为50 CFU/mL时，捕获效率仍达到89.33%（图2D）。这些结果指出，制备的IMBs对金黄色葡萄球菌表现出良好的捕获特性。

图2 优化针对金黄色葡萄球菌的免疫磁珠（IMBs）捕获系统。（A）确定添加鸡抗蛋白A IgY的量。（B）在不同浓度（25、50、100、200、400、600、800和1000 lg）下准备的IMBs对金黄色葡萄球菌的捕获效率（5.0×10^5 CFU/mL）。（C）IMBs捕获金黄色葡萄球菌（5.0×10^5 CFU/mL）能力的效率，在不同的孵育时间。（D）在不同浓度的金黄色葡萄球菌培养液中，准备的IMBs（400 lg）的捕获效率。实验重复了3次。数据以平均值±SEM表示（*P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，'ns'表示无显著差异）。

 研究人员继续对GICA进行优化。统计分析结果显示，基于肉眼观察到的标记溶液颜色和521 nm处的吸光度（图3A），胶体金标记的抗体在pH 10.0时具有最大的效果。向200 μL的胶体金中添加5 μL的1 mg/mL金黄色葡萄球菌抗体足以形成稳定的胶体金-抗体复合物。在25 μg/mL的抗体标记下，其效果优于低于25 μg/mL的添加量。发现25 μg/mL的抗体标记效果与超过25 μg/mL的添加效果无显著差异，因此，标记蛋白的最佳剂量为25 μg/mL（图3B）。

T线（LysGH15-C54A）和C线（山羊抗兔IgG抗体）在不同的浓度下稀释，并组装成实验用的试纸。当T线和C线的包被浓度均为0.8 mg/mL时，试纸上的显色效果良好（图3C和D）。

图3 GICA优化。(A)胶体金标记的最佳pH值。(B)抗体标记的最佳条件确定。(C)C线工作浓度的确定。(D)T线工作浓度的确定。

 接下来，研究人员检验了IMBs-GICA方法的灵敏度和特异性。为评估IMBs-GICA方法检测金黄色葡萄球菌（S. aureus）的灵敏度，在最佳条件下测试了不同浓度的菌悬液。如图4B所示，随着金黄色葡萄球菌浓度的增加，GICA试纸条上的T线颜色持续加深。当金黄色葡萄球菌的倍比稀释为5.0×10^6至5 CFU/mL时，T线颜色较弱，50 CFU/mL浓度下出现此现象；与阴性对照（T线上未出现红色线）相同，5 CFU/mL浓度下观察到相同结果。因此，临界值被确认为5至50 CFU/mL之间。如图4C所示，目视检测显示，目视检出限（vLOD）为40 CFU/mL，这是导致T线显色的最低金黄色葡萄球菌浓度。此外，采用ImageJ软件分析了T线的显色情况，在检测范围内（5至5.0×10^6 CFU/mL）获得了灰度值与检测浓度的线性关系（图4A）。回归方程为Y = 0.51682X + 0.83681（R² = 0.9965）。

利用该方法检测到十种非目标细菌，用以评估对金黄色葡萄球菌的特异性。如图4D所示，仅在T线和C线上，金黄色葡萄球菌样本呈现红色条带。其他非目标细菌，包括表皮葡萄球菌和表皮葡萄球菌，仅在C线上呈现一个条带，证实了所开发的方法对金黄色葡萄球菌检测具有高特异性，且未发生交叉反应。

研究人员进一步进行了金黄色葡萄球菌临床样本检测。培养、PCR和IMBs-GICA检测方法分别达到了8.92%、7.17%和8.45%的总体检出率（图4E）。与其他方法相比，IMBs-GICA方法在痰液样本中获得了最高的检出率（10.81%）。总共有36个样本为IMBs-GICA阳性，其中2个为金黄色葡萄球菌培养阴性。相反，38个金黄色葡萄球菌培养阳性样本中，有34个在IMBs-GICA中呈阳性。与金标准培养方法相比，IMBs-GICA对所有426个样本的总灵敏度为89.5%（95% CI 74.3–96.6），特异性为99.5%（97.9–99.9），阳性预测值（PPV）为94.4%（80.0–99.0），阴性预测值（NPV）为99.0%（97.2–99.7）（表1）。不同标本类型的特异性和NPV均至少为98.5%和98.2%。

图4 IMBs-GICA方法灵敏度性能测试。（A）金黄色葡萄球菌灰度值的回归曲线。（B）和（C）IMBs-GICA方法的灵敏度。（D）IMBs-GICA方法对金黄色葡萄球菌和其他细菌的特异性。（E）检测率的比较。痰、支气管肺泡灌洗液（BALF）、尿液和血清样本的培养方法、PCR和IMBs-GICA分析以及总体检测率。

 表1 IMBs-GICA在不同样本类型中对金黄色葡萄球菌的检测，与培养结果的相对关系。

综上所述，本研究首次将噬菌体裂解酶应用于GICA的T线，用于检测金黄色葡萄球菌。此外，与鸡IgY偶联的MBs被用来选择和富集样本中的金黄色葡萄球菌。这种双重识别模式方法具有高特异性和灵敏度，展示了该方法在金黄色葡萄球菌检测领域的潜在应用价值。

 论文来源：https://doi.org/10.1016/j.jare.2025.01.034