基于CRISPR技术的检测方法用于肾移植后BK病毒和JC病毒感染检测

1.引言

肾移植后免疫抑制患者易受BK病毒（BKV）和JC病毒（JCV）感染，二者可能引发多瘤病毒相关性肾病（PVAN），甚至导致移植肾丢失，及时检测与监测病毒载量十分关键。

现有检测方法存在明显局限：组织学活检有创且风险高，尿细胞学检查易受主观因素影响而误判，qPCR需专用实验室与设备，难以实现即时检测；RPA技术虽可替代PCR，但易出现非特异性扩增导致假阳性。CRISPR/Cas系统能弥补RPA缺陷，然而此前相关方法芯片集成度低，且无法同时检测BKV和JCV，难以满足临床共感染检测需求，因此亟需开发创新检测平台。

在本研究中，为开发BK病毒（BKV）和JC病毒（JCV）的检测方法，研究人员将自制的双液滴微芯片与侧流条分别集成到RPA-CRISPR技术中，相应构建出两种检测体系，分别命名为ddCRISPR与LFCRISPR（图1）；其中，ddCRISPR通过结合集成双液滴微芯片，可借助不同荧光探针同时检测BKV和JCV两个靶标，并依托数字液滴技术实现两种病毒的同步绝对定量，而针对临床场景中BKV与JCV快速筛查的需求，研究人员开发的基于CRISPR的侧流检测方法（LFCRISPR），则可用于这两种病毒的即时检测，进一步适配现场检测场景。

图1.BK病毒（BKV）和JC病毒（JCV）在肾移植患者体内检测的ddCRISPR和LFCRISPR示意图。肾移植后，使用ddCRISPR检测或持续监测BKV和JCV感染者，而LFCRISPR用于早期感染筛查。ddCRISPR双液滴微芯片集成了RPA-CRISPR，LFCRISPR侧流条集成了RPA-CRISPR，FAM6-羧基荧光素，AuNPs金纳米颗粒。

2.结果

一锅RPA-CRISPR检测方法的建立与优化：本研究建立并优化一锅RPA-CRISPR检测方法，37℃下30分钟内完成BKV和JCV检测。筛选出最优crRNA、Cas13a（100nmol/L）及RPA引物，确定crRNA最佳浓度10nmol/L，经特异性验证，与其他7种病毒无交叉反应。

图2.一锅RPA-CRISPR检测方法的建立与优化。a：一锅RPA-CRISPR检测方法的示意图。目标DNA通过RPA扩增。随后，使用T7RNA聚合酶进行RNA转录。最后，当crRNA与目标RNA结合时，Cas13a的跨链切割活性被激活，从而促进荧光检测。b：使用三种不同crRNA检测BKV和JCV的效率比较（n=3）。c：BKV-crRNA和JCV-crRNA浓度的优化（n=3）。d：BKV和JCV引物优化的热图（n=3）。结果已标准化（b,c,d）。数据以平均值±标准差表示。crRNA成簇规律间隔短回文重复RNA，dsDNA双链DNA，ssRNA单链RNA，RPA重组酶聚合酶扩增，BKVBK病毒，JCVJC病毒，NC阴性对照。

ddCRISPR检测评估：ddCRISPR以双液滴微芯片集成RPA-CRISPR，液滴尺寸均匀（平均直径92.43±4.41μm）。对BKV、JCV检测限分别达10拷贝/mL、1拷贝/mL，优于qPCR，无交叉反应，能同时准确定量高/低浓度病毒混合物，检测耗时短（37分钟）。

图3.评估ddCRISPR检测方法。a：双液滴微芯片的基本结构。b：微芯片的3D插图（上）和物理插图（下）。c：ddCRISPR检测方法的流程。在两个液滴生成通道后，所有液滴在37℃下孵育30分钟，并在荧光场中检测以读取结果。d：代表性荧光图像，用于BKV和JCV检测的DNA浓度系列稀释，以评估灵敏度。标尺=500μm。e：特异性评估的代表性结果。标尺=200μm。f：显示同时检测能力的代表性荧光图像，使用高浓度和低浓度混合物。左，封装CY5用于BKV检测的液滴；中，封装FAM用于JCV检测的液滴；右，左图和中图的合并图像。标尺=500μm。g：分别显示高浓度（左）和低浓度（右）混合物的散点图。I和II表示液滴生成单元，III表示液滴检测区，BKVBK病毒，JCVJC病毒，NC阴性对照，crRNA成簇规律间隔短回文重复RNA，FAM6-羧基荧光素，CY5花青5，BKV（+）BK病毒（阳性），JCV（+）JC病毒（阳性），BKV（-）JCV（-）BK病毒（阴性）和JC病毒（阴性），ddCRISPR集成RPA-CRISPR的双液滴微芯片，3D三维。

ddCRISPR检测的临床应用：研究用ddCRISPR检测125份临床样本，检测BKV灵敏度、特异性均100%，JCV分别为96.0%、100%，与qPCR结果相关性高。还监测1例肾移植共感染患者6个月病毒载量，助力疗效观察与个体化精准治疗，仅1例因干扰物质呈假阴性。

图4.ddCRISPR的临床应用。a：使用ddCRISPR检测和qPCR对血液和尿液样本中的BKV和JCV进行对比分析的流程。b：芯片检测与qPCR检测BKV的一致性（左）和相关性（右）。c：ddCRISPR检测与qPCR检测JCV的一致性（左）和相关性（右）。d：两种方法在共感染病例中检测BKV的一致性（左）和相关性（右）分析。e：两种方法在共感染病例中检测JCV的一致性（左）和相关性（右）分析。f：展示病例1至125的ddCRISPR结果热图。BKVBK病毒，JCVJC病毒，qPCR定量聚合酶链式反应，Ct循环阈值，ddCRISPR双液滴芯片集成RPA-CRISPR。

图5.使用ddCRISPR监测肾移植后患者的病毒载量。a：肾移植后持续监测病毒载量的示意图。比例尺=500μm。b：手术后6个月内监测BKV和JCV感染以及尿白蛋白肌酐比（UACR）。c：该病例使用ddCRISPR监测6个月的滴液结果。d：该病例使用ddCRISPR监测6个月的荧光散点图。BKVBK病毒，JCVJC病毒，FAM6-羧基荧光素，CY5花青5，ddCRISPR集成了RPA-CRISPR的双滴液微芯片。

LFCRISPR检测方法的建立与临床应用：研究将CRISPR与侧流条结合建LFCRISPR，ssRNA报告分子两端修饰生物素和FAM。其检测BKV、JCV灵敏度为1×10²拷贝/μL，与qPCR结果高度一致，仅1例未检出JCV。可肉眼定性或灰度半定量，适用于资源有限环境筛查。

图6.LFCRISPR检测方法的建立与临床应用。a：LFCRISPR检测方法的原理示意图。在阳性测试中，当Cas13a被目标RNA激活时，它会切割FAM-生物素配对报告分子，并释放FAM分子在测试带上进行检测。在阴性测试中，未切割的报告分子通过生物素与控制带上的链霉亲和素结合而被捕获。b：LFCRISPR对BKV和JCV标准的灵敏度（n=3）。c：RPA-CRISPR-LFA检测BKV和JCV的校准标准曲线（n=3）。d：LFA与qPCR在临床样本分析中的结果一致性。e：展示BKV和JCV检测定量结果的矩阵图（对应d）。f：在健康个体和肾移植受体的相同临床样本中检测BKV和JCV的散点图，如d所示。P值通过双尾Student'st检验计算。^****P<0.0001。数据表示为平均值±标准差（b,c）。LFCRISPR侧流条带集成RPA-CRISPR、AuNPs金纳米颗粒、crRNA规律间隔短回文重复RNA、FAM6-羧基荧光素、LFA侧流测定法、BKVBK病毒、JCVJC病毒、qPCR定量聚合酶链式反应。

3.总结

本研究聚焦肾移植后BK病毒（BKV）和JC病毒（JCV）感染检测，开发两种基于RPA-CRISPR的检测平台。建立并优化一锅RPA-CRISPR体系，筛选出最优crRNA、Cas13a（100nmol/L）及RPA引物，crRNA最佳浓度10nmol/L，与其他病毒无交叉反应。在此基础上构建ddCRISPR，以双液滴微芯片集成技术，液滴均匀，对BKV、JCV检测限分别达10拷贝/mL、1拷贝/mL，优于qPCR，能同步定量且耗时短。临床检测125份样本，与qPCR相关性高，还成功监测患者病毒载量助力治疗。同时开发LFCRISPR，灵敏度1×10²拷贝/μL，可肉眼判读，适用于资源有限环境筛查，为移植术后病毒检测提供有效工具。

 论文链接： https://doi.org/10.1186/s40779-025-00632-0