新型前向照明SPR生物传感器，为光响应蛋白研究带来突破

原创

来源：李康倩

2025-11-21 10:16:04

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核心提示：捷克科学家团队成功研发出一款名为“前向照明表面等离子体共振生物传感器”，首次实现对光响应蛋白在光照条件下的实时、原位动力学分析。

背景：光响应蛋白的研究困境

光响应蛋白广泛存在于细菌、植物和动物中，参与调控多种关键生理过程，如细菌的环境适应、植物的生长调控、动物的视觉与生物钟节律等。此外，工程化的光响应蛋白在生物技术与医学中也显示出巨大潜力，例如用于光控基因表达或细胞信号通路。

然而，这类蛋白通常具有“光照状态”寿命极短、需持续光照才能维持活性的特点。例如，蓝光响应转录因子EL222的“光照状态”仅能维持数秒。这使得研究其与DNA或其他蛋白的相互作用变得极为困难。

传统的研究方法，如X射线衍射、核磁共振、光谱分析、电泳迁移实验等，虽能提供结构或平衡状态信息，但无法实现实时、原位、在光照下的动力学分析。表面等离子体共振技术虽在生物分子互作研究中广泛应用，却因无法同时实现光学监测与样品光照而一直未能用于光响应蛋白的研究。

技术突破：fISPR生物传感器的设计与原理

为解决这一难题，捷克科学院光子与电子研究所及生物技术研究所的联合团队，开发出名为 “前向照明表面等离子体共振（fISPR）生物传感器” 的新型平台。

该系统的核心创新在于将基于Kretschmann构型的SPR光学平台、透明微流控系统与前向照明模块三者结合：

1.SPR光学部分：通过棱镜耦合与光谱调制，监测传感器表面折射率变化，实时反映生物分子结合情况。

2.透明微流控系统：包含“孵育区”与“传感区”，样品在孵育区接受光照后被引导至传感区进行SPR检测。

3.前向照明模块：通过玻璃窗向SPR芯片前方的液体样品提供特定波长（300–700 nm）的窄带光，确保蛋白在测量过程中始终处于光照状态。

此外，系统采用双通道参考补偿设计，有效排除非特异性结合与体积折射率变化的干扰。

图1. fiSPR生物传感器示意图（左）和微流控系统架构细节（右）

应用案例一：EL222的二聚化与DNA结合机制

研究团队以蓝光转录因子EL222为模型，系统研究了其在光照下的二聚化及与DNA结合的动力学过程。

关键发现：

1.光照依赖性结合：

EL222仅在蓝光（450 nm）照射下才能与特定DNA序列结合，黑暗状态下或使用乱序DNA时几乎无结合。

2.二聚化先于DNA结合：

实验表明，EL222单体无法直接与DNA结合，必须先在光照下形成二聚体。二聚体形成过程复杂，存在两种构象状态（D1与D2），需用双状态结合模型拟合。

3.必须原位照明：

若在测量前对EL222进行离体光照，其结合能力随延迟时间迅速下降，3分钟后结合显著减弱，30分钟后几乎消失。这说明持续原位照明对维持EL222活性至关重要。

4.动力学常数首次测定：

通过fISPR，团队首次获得了EL222二聚化及其与DNA结合的各项速率与平衡常数，结果与瞬态光栅光谱、电泳迁移实验等传统方法相符，验证了数据的可靠性。

图2. 检测1和检测2的示意图（未按比例绘制）。传感器表面被照亮的区域标记为黄色。在检测1中，EL222被注入到检测通道和参考通道中。在检测2中，双链DNA或EL222被注入到两个通道中。

图3. 光照对EL222–DNA相互作用的影响。a) 参考补偿后的传感器响应，显示EL222与共识DNA结合时的响应（无光照和有光照），以及与打乱序列DNA的结合响应（有光照）。b) 在六种不同波长光照下，使用fiSPR生物传感器测量EL222与DNA结合的参考补偿传感器响应。c) EL222–DNA传感器响应随光照波长的变化曲线，并叠加EL222暗态的紫外-可见光谱（吸光度以吸光单位a.u.表示）。d) 在五种不同光强下，使用fiSPR生物传感器测量EL222与DNA结合的参考补偿传感器响应。